Fluorospark® 激酶/ADP 多重-检测试剂盒 Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit


产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 产品价格
291-77401 Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit
 Fluorospark®激酶/ADP 多重-检测试剂盒
1000次
297-77403 Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit
 Fluorospark®激酶/ADP 多重-检测试剂盒
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激酶分析筛选试剂盒

Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit

Fluorospark® 激酶/ADP 多重-检测试剂盒                   Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit

  Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit是和光与日本东京大学新药研究机构共同研发的ADP荧光检测试剂盒。拥有高通量筛选(HTS)所必须的高灵敏度、高准确度、低成本、简便等特性。本产品不仅可检测激酶,同时可用于检测产生ADP的酶(如ATP酶、乙酰基—CoA羧化酶)的活性。



◆原理:

Fluorospark® 激酶/ADP 多重-检测试剂盒                   Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit


  本试剂盒通过酶偶联反应简单、高灵敏度的定量检测ADP。通过激酶反应产生的ADP用红色荧光物质试卤灵定量。

优点、特色:

●   适合终点(endpoint)和实时实验

●   优异的Z'-factor数据(数据差异小)

●   高灵敏度检测ADP量

●   检测直到ADP 30μmol/L仍可保持线性关系

●   一步反应,检测时间短(~30分钟)

●   成本较低

与传统方法(发光)比较


试剂名称

Fluorospark® Kinase

传统发光法(A公司)

原理

ADP定量(荧光)
  (直接定量生成的ADP)

ADP定量(发光)
  (需要把生成的ADP变换成ATP再定量)

操作顺序

1

2

所需时间

30分钟

70100分钟

ADP定量范围

〜30μmol/L

1mmol/L

价格

低成本

高成本

优点

Z'-factor数值高
  适合实时、终点反应

动态范围大
  S/B比高

 

试剂盒组成


No. 试剂

用途

1,000

10,000

底物液

2×制备检测液

9mL

90mL

酶液

500μL

5mL

刃天青液

100μL

1mL

还原封闭剂

400μL

4mL

D 终止液

停止偶联反应

10mL

100mL

10mmol/L ATP溶液

激酶反应,制作标准曲线

100μL

1mL

10mmol/L ADP溶液

制作标准曲线

100μL

1mL

案例、应用:

【实验流程(终点(endpoint)法)】


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  激酶反应液里添加等量的2x检测液(使用时制备)即可检测激酶活性




制作ADP标准曲线

用0、10、20、30μmol/L ADP制作标准曲线。

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  良好的线性关系可定量最多至30μmol/L的ADP。




【低浓度ADP区域里定量】

制作各ATP/ADP浓度(ATP+ADP=1,10,100μmol/L)里底物变换率0-10%标准曲线


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  ATP/ADP标准曲线里底物变换率低(=ADP浓度低)时线性关系依然较好

 


荧光信号的稳定性

20μmol/L ADP和2x检测液混合,在30分钟~7小时候检测荧光强度。30分钟后的荧光强度标准化为100%,相关变动表格如下。

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  ADP和2x检测液混合后,在30分~7小时内的荧光信号十分稳定。

【数据:Z'-factor实测值】

定量与各ATP/ADP浓度(ATP+ADP=1,10,100μmol/L),5%底物变换率相当的ADP时,本试剂盒方法与传统发光法的Z'-factor比较。


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  Z'-factor:Fluorospark® Kinase >传统发光法(A公司)

  在各ATP浓度里,5%低底物变换率也有优异的Z'-factor



什么是Z'-facotr
  是一个关于信号区间和变异的组合,它已成为评估测试方法质量的主要参数。使用Z'-factor = 1 – (3×SDH + 3×SDL)/(AvH-AvL)公式计算(SDH和SDL为阳性对照和阴性对照的方差,AVH和AVL为阳性对照和阴性对照的平均值)。


 Z-factor  Interpretation

 1.0

 理想情况下等于1.0。Z factor永远不可能超过1.0。

 0.5 – 1.0之间

 较好的实验。

 0 – 0.5 之间

 临界的实验(较差的实验)。

 小于0

 阳性对照和阴性对照的数值有很多重叠。

【制作抑制曲线】

  制作cAMP- 依赖性蛋白激酶(PKA)抑制剂H-89的抑制曲线

  (PKA 0.02U/μL,ATP 5μmol/L,Kemptide 125μg/mL及各浓度的H-89)


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  Fluorospark® Kinase与传统发光法(A公司)有几乎相同的IC50值。

  (本方法得到的H-89 IC50值与文献值*IC50=40nmol/L)几乎相同)

  * Hidaka, H. et al., Methods Enzymol., 201, 328-39(1991).




【实验流程(实时法)】

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  通过实时检测荧光强度,实时检测激酶活性。

【ADP定量反应时间的比较(实时检测)】

  对各浓度ADP[ADP=0, 0.25, 0.5, 1, 2μmol/L(ATP+ADP=10μmol/L)]进行实时检测。

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  Fluorospark® Kinase在约十分钟内完成ADP定量反应。背景(ADP=0μmol/L)信号稳定。




【实时检测添加DTT的影响】

  ADP=2μmol/L(ATP+ADP=10μmol/L)里添加还原剂DTT(0.1、1mmol/L),进行实时检测。

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  Fluorospark® Kinase在约十分钟内完成ADP定量反应。即使DTT浓度增高,结果依然稳定。

【通过实时检测计算PKA的Km(ATP)值】

  在各种ATP浓度下通过实时检测计算出PKA反应速度,并求取ATP的PKA(Km值)。

  (PKa 0.02U,各浓度的ATPKemptide 100μg/mL


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  根据实时检测进行酶的动力学分析。

  (本方法得到的Km值与文献值**(3〜15μmol/L)几乎相同)

  ** Flockhart, D.A. and Corbin, J.D., CRC Crit. Rev. Biochem., 12, 133-86(1982).

相关资料


Fluorospark® 激酶/ADP 多重-检测试剂盒                   Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit


Fluorospark® Kinase ADP Multi-Assay Kit.pdf

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说明书.pdf

Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit 参考资料>
1) Kumagai, K. et al.: Anal. Biochem., 447, 146-155 (2014).
2) 东京大学新药研究机构网址 
http://www.ddi.u-tokyo.ac.jp/

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