AbFluor® 594 标记鬼笔环肽 (微丝红色荧光探针)

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产品编号 C8002
英文名称 Phalloidin/AbFluor® 594
中文名称 AbFluor® 594 标记鬼笔环肽 (微丝红色荧光探针)
别    名 AbFluor® 594-Phalloidin (Red);   鬼笔环肽AbFluor 594偶联物; 微丝荧光探针(红色);
保存条件 -20℃避光干燥保存,有效期1年。
注意事项 This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications.
产品介绍 产品描述:
鬼笔环肽(Phalloidin)是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)的环状七肽毒素,以高亲和力(Kd= 20 nM)选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin,而不会与单体肌动蛋白G-actin结合,通常用来标记组织切片,细胞培养物或无细胞体系中的F-actin,从而对F-actin进行定性和定量分析。另外,鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维,无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞,按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。且非特异性结合几乎可忽略,染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此,鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白(Actin)抗体进行相关研究。另外鬼笔环肽衍生物很小,直径约12-15Å,分子量<2000 Daltons,未标记肌动蛋白(Actin)的许多生理特性都得以维持,比如,同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白,原肌球蛋白,DNase I等仍能发生反应;鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质;以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。
鬼笔环肽(Phalloidin)的结合阻止丝状肌动蛋白(微丝)的解离,稳定微丝结构,从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度(CC)降至<1µg/mL,因此,可用作一种聚合促进剂。此外,鬼笔环肽还可抑制F-actin的ATP水解活性。
本品为AbFluor 594标记的鬼笔环肽,染色反应特异性强,对比性高,具有比Actin抗体更好的染色效果,适合用作F-actin的定性和定量检测。另外,经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性,适用性广泛。

工作液配制:
本品为 20µM 储存液,总量为 300µL。按照 100 nM 的工作液浓度来换算,可制备总量为 60 mL 的工作液。建议收到产品后,根据单次使用量分装保存,-20℃避光冻存,一年稳定。
实验前,用 1×PBS稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为:80~200nM(1:100-250 倍稀释),工作液现配现用。最佳稀释比例可以根据实际染色效果进行适当调整。

染色步骤:
1. 细胞爬片生长 24h,使其密度达到 50%汇合度。
2. 吸掉培养液,37℃预热的 1×PBS(pH 7.4)清洗细胞 2 次。
3. 使用4%甲醛PBS溶液进行细胞固定,室温固定 10min。
注:避免固定剂中含有甲醇成分,因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。
4. 室温条件下,用 PBS 清洗细胞 2~3 次,每次 10min。
5. 室温条件下,用丙酮(≤-20℃)脱水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化处理 5min。
6. 室温条件下,用 PBS 清洗细胞 2~3 次,每次 10min。
7. 取 200µl 配制好的 AbFluor 594 标记鬼笔环肽工作液,覆盖住盖玻片上的细胞,室温避光孵育 30min(通常情况下,4℃~37℃ 孵育皆可)。
注:为了降低背景,可于 AbFluor 594 标记的鬼笔环肽工作液内加入 1% BSA;另外,孵育过程中为了避免溶液挥发,可将盖玻片转移到一个密封的容器内。
8. 用 PBS 清洗盖玻片 3 次,每次 5min。
9. 用 200µl DAPI 溶液(浓度:100 nM)对细胞核进行复染,约 30s。
10. 用 PBS 清洗盖玻片,然后倒置在已经滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂,然后用指甲油永久封片。此法制备的标本玻片可置于 4℃避光保存,通常 6 个月内可继续做 F-actin 染色分析。
注:也可以直接使用含有 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂合并步骤 9. 10。
11. 荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察,AbFluor 594(Ex/Em=590/618nm),DAPI(Ex/Em=364/454nm)。

注意事项:
1. 鬼笔环肽具有毒性,需小心操作(对人的半数致死剂量 LD50 约 2mg/kg)。
2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。