3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase酶试剂盒Takara


3’-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase
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Takara 6106 3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase 20 Rxns ¥1,893 3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase 3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase 3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase
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■ 制品内容 (20 次量)
制品内容1~9项为用于3’RACE实验的反转录用试剂,可用于20次反转录反应 (约100次3’RACE PCR反应);10~12为Control实验用试剂,可进行5次Control实验。
1. PrimeScript RTase (200 U/μl) 10 μl
2. RNase Inhibitor(40 U/μl) 10 μl
3. 5 × PrimeScript Buffer 40 μl
4. dNTP Mixture (10 mM each) 20 μl
5. 3’RACE Adaptor (5 μM) 20 μl
6. RNase Free dH2O 1 ml
7. 1 × cDNA Dilution Buffer II 1 ml
8. 3’RACE Outer Primer (10 μM ) 200 μl
9. 3’RACE Inner Primer (10 μM ) 200 μl
10. Control HL60 Total RNA (500 ng/μl)* 10 μl
11. 3’RACE Control Outer Primer (10 μM)* 10 μl
12. 3’RACE Control Inner Primer (10 μM)* 10 μl
   
* 用于扩增Human Prohibitin (PHB) 基因。
 
■ 制品说明
本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增cDNA 3’末端全长的试剂盒。对RNA结构进行分析时,一般先通过RT-PCR反应扩增目的区域,然后再对扩增出的目的DNA片段进行克隆、序列分析等。一般的RT-PCR反应很难得到全长的cDNA片段,然而在基因工程研究中,分析遗传基因的全长cDNA序列又是十分重要的。RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 法能有效地解决这一问题。3’-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase能够通过已知的cDNA序列,高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的3’末端的全长序列。
本试剂盒中含有完成3’-RACE操作的主要试剂。试剂盒中使用的PrimeScript Reverse Transcriptase经过了本公司的特殊改良,反转录性能良好,无RNase H活性,大大增加了反转录性能。结合使用TaKaRa LA Taq (Code No.: RR002A) 进行PCR扩增时,其3’RACE的扩增性能大大优于其他同类产品。 本试剂盒应用了套式PCR原理,增加了PCR扩增的特异性与灵敏度,可以对少量样品或低丰度的基因进行3’RACE实验,并且对长片段的3’RACE扩增具有明显优势,我们曾经使用本试剂盒成功扩增了8 kb的3’RACE DNA片段。使用TaKaRa LA Taq 扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A” 碱基,其产物可直接克隆于T-Vector中。反转录引物3’RACE Adaptor Primer含有由Takara特别设计的dT区域,反转录效率高。3’RACE Inner Primer中含有BamH I酶切位点,为克隆实验提供了方便。制品中的Control RNA及Control Primer可以用于Control实验。
 
■ 各种引物的序列
引物名称 引物序列 (5→3)
   3’RACE Adaptor    含有由Takara特别设计的dT区域及Adaptor Primer部分
   3’RACE Outer Primer    TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
   3’RACE Inner Primer    CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG
   3’RACE Control Outer Primer    GAGTGCAGGACATTGTGGTAGGG
   3’RACE Control Inner Primer    ATCTTTGACTGCCGTTCTCGACC
 
 
■ 试剂盒原理
进行3’RACE 实验时,首先由PrimeScript Reverse Transcriptase将Poly(A)+RNA反转录成cDNA,然后再使用TaKaRa LA Taq (Code No.: RR002A),以反转录的cDNA为模板,进行套式PCR反应。3’RACE Adaptor Primer作为反转录引物用于cDNA合成 (具体原理见图1)。
 
3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase
图1. 3’-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase的实验原理图
 
1. 以Total RNA为模板,使用3’RACE Adaptor引物进行反转录反应,合成1st Strand cDNA。
2. 使用上游外侧特异性引物 (GSP1) 和3’RACE Outer Primer进行1st PCR反应。如果1st PCR反应未能得到目的产物,再使用上游内侧特异性引物 (GSP2) 和3’RACE Inner Primer进行2nd PCR反应。
3. PCR产物可以直接进行DNA测序或TA克隆。如果使用含有BamH I酶切位点的上游内侧特异性引物进行2nd PCR扩增时,可以使用限制酶 (BamH I) 对PCR产物进行酶切反应,然后克隆至相关的载体中。
 
■ 注意事项
1. 同时需要进行数次反转录反应或PCR反应时,应先配制各种试剂的混合液 (Master Mix;其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture等),然后再分装到每个反应管中。这样,可使所取的试剂体积更准确,减少试剂损失,避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。
2. 使用PrimeScript Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor等酶类时,应轻轻混匀,避免起泡,分取之前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油,粘度高,分取时应慢慢吸取。
3. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出,使用后也应立即放回-20℃中保存。
4. 为了防止Control RNA分解,应尽量避免反复冻融。有条件的实验室建议保存于-70℃至-80℃。
5. 分装试剂时务必使用新的枪头 (Tip),以防止样品间污染。
 
 

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