realtimeprimers qPCR 预混液简介

qPCR Master Mix- 新的高性能快速绿色 qPCR Blue Master Mixes

定量实时 PCR 引物套装

概述 – 定量“实时”PCR 或 qPCR

定量实时 PCR *改变了我们测量核酸浓度的能力，并且是验证由微阵列分析和其他基因组学技术生成的表达数据的重要步骤。实时 qPCR 仪器的开发促进了这一点，该仪器可测量反应每个步骤或“实时”产生的 qPCR 产物的量。SYBR green 是目前流行的实时 PCR 方法，因为它相对容易和可靠。在实时 PCR 技术发展之前，定量测量需要建立多个 PCR 反应，以便在扩增的线性阶段捕获 qPCR 产物。然后通过凝胶电泳或 HPLC 对 PCR 产物进行分离和定量。这些实验非常费力，实现正确定量所需的操作次数增加了引入错误的可能性。因此，可以在每个热循环中测量 PCR 产物的实时 PCR 仪器的开发提高了定量 PCR 的简便性、准确性和可重复性。由于实时 PCR 的发现，出现了各种应用。这些包括 1) 验证通过微阵列分析或下一代测序 (NGS) 获得的基因表达数据，2) DNA 拷贝数的测量，3) 病毒颗粒和潜在致命微生物的检测和定量，4) 突变/SNP 分析，以及5）miRNA表达。可以在每个热循环中测量 PCR 产物的实时 PCR 仪器的开发提高了定量 PCR 的简便性、准确性和可重复性。由于实时 PCR 的发现，出现了各种应用。这些包括 1) 验证通过微阵列分析或下一代测序 (NGS) 获得的基因表达数据，2) DNA 拷贝数的测量，3) 病毒颗粒和潜在致命微生物的检测和定量，4) 突变/SNP 分析，以及5）miRNA表达。可以在每个热循环中测量 PCR 产物的实时 PCR 仪器的开发提高了定量 PCR 的简便性、准确性和可重复性。由于实时 PCR 的发现，出现了各种应用。这些包括 1) 验证通过微阵列分析或下一代测序 (NGS) 获得的基因表达数据，2) DNA 拷贝数的测量，3) 病毒颗粒和潜在致命微生物的检测和定量，4) 突变/SNP 分析，以及5）miRNA表达。

通常，实时 PCR 协议类似于标准 PCR 反应。同样的问题也适用于产生干净的模板、设计引物和优化反应条件。主要区别在于加入了嵌入剂（例如 SYBR green）或使用荧光引物检测 PCR 产物。在典型的反应中，qPCR 产物以指数方式产生。因为足够的产品需要几个循环才能很容易检测到，所以荧光与循环数的关系图呈现出 S 形外观。在随后的循环中，反应底物耗尽，qPCR 产物不再加倍，曲线开始变平。曲线上荧光量开始迅速增加的点，通常比基线高几个标准偏差，称为阈值循环（Ct 值）。Ct 与模板的关系图是线性的，因此多个反应之间的 Ct 值比较可以计算目标核酸的浓度。这条线的斜率提供了 qPCR 效率的度量。

PCR产物可以通过产生标准曲线来定量或相对于对照基因进行定量。基于标准曲线的实时 PCR 定量可以利用质粒 DNA 或其他形式的 DNA，其中每个标准的绝对浓度是已知的。然而，必须确定的是，标准品的 PCR 效率与“未知”样本的效率相同。在某些情况下，从纯化的靶标进行 PCR 可能比使用复杂核酸混合物观察到的更有效。相对定量方法稍微简单一些，因为它需要测量管家或对照基因来标准化目标基因的表达。然而，选择合适的对照基因可能会导致问题，因为它们不一定在所有未知样本中均等表达。

执行实时 PCR 的一个关键方面是从高纯度的模板开始。在处理一些生物样本时，这可能具有挑战性。幸运的是，已经开发了许多商业产品来促进高纯度核酸的分离。去除污染的苯酚和不需要的 DNA 是需要考虑的步骤。对于基因表达研究，必须使用高纯度试剂和多次重复进行逆转录，因为此步骤可能会在模板复制中引入可变性。逆转录可以在实时 PCR 之前进行，或者可以合并到扩增程序中。