pUCm-T载体(D2006)

pUCm-T载体(D2006)
pUCm-T载体
产品编号: D2006
产品包装: 20次
产品价格: 253.00元
产品简介
产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D2006 pUCm-T载体 20次 253.00元

pUCm-T载体(pUCm-T Vector)是用于克隆含有A末端PCR产物的理想载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片段的重组克隆。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体,载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样,pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的催化下,就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中,形成含有目的片段的重组载体。

pUCm-T载体的主要信息如下:
Base pairs 2773
Lac Z promoter 142-171
M13/pUC Reverse Primer 204-221
Lac Z 222-534
Multiple cloning region 233-376
M13/pUC Sequencing Primer 378-395
Synthetic Beta-lactamase (Ampr) coding region 972-1832
ColE1 origin of replication(rep) 1987-2606

pUCm-T载体的图谱如图1:

pUCm-T载体(D2006)
图1. pUCm-T载体图谱示意图

pUCm-T载体的多克隆位点的详细序列如下(请特别注意其中的Pst I不是单酶切位点):

  Lac Z
201 ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTTGC ATGCCTGCAG
TGTGTCCTTT GTCGATACTG GTACTAATGC GGTTCGAACG TACGGACGTC
Xba I Xho I BamH I Bgl II
251 GTCGACTCTA GACTCGAGGG ATCCAGATCT CCAGTCTT GA CCTGGTCTGC
CAGCTGAGAT CTGAGCTCCC TAGGTCTAGA GGTCAGA TCT GGACCAGACG
Pst I Not I Nco I EcoR V Cla I Nde I T7 promoter
301 AGGCGGCCGC CCATGGGATA TCATCGATCA
TATGTCGC CC   TATAGTGAGT
TCCGCCGGCG GGTACCCTAT AGTAGCTAGT
ATACAGCG GG   ATATCACTCA
Kpn I Sac I EcoR I
351 CGTATTACGG TACCGAGCTC GAATTCACTG GCCGTCGTTT TACAACGTCG
GCATAATGCC ATGGCTCGAG CTTAAGTGAC CGGCAGCAAA ATGTTGCAGC

pUCm-T载体中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pUCm-T)包括:

Afl II Age I Apa I Asc I Avr II Bbs I Bbv II Bcl I
Blp I BsaA I BseR I Bsg I BsiC I BsiW I Bsm I BsmF I
Bsp120 I BspM II BsrG I BssH II Bst1107 I BstB I BstE II BstX I
Bsu36 I Dra III Eco47 III Eco72 I Esp I Fse I Hpa I Mlu I
Msc I Mun I Nae I NgoM I Nhe I Nru I Nsi I PflM I
Pme I Pml I PpuM I PspA I Rsr II Sac II Sfi I Sma I
SnaB I Spe I Spl I Srf I Stu I Xca I Xma I

pUCm-T载体中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pUCm-T once)包括:

HinD IIIA`AGCT,T234Acc65 IG`GTAC,C360BspM IACCTGC 10/14239Asp718G`GTAC,C360Sph IG,CATG`C244Kpn IG,GTAC`C364Sal IG`TCGA,C252Ban IIG,RGCY`C370Acc IGT`MK,AC253Sac IG,AGCT`C370HinC IIGTY|RAC254Apo IR`AATT,Y372Hind IIGTY|RAC254EcoR IG`AATT,C372Xba IT`CTAG,A258Kas IG`GCGC,C533Ava IC`YCGR,G264Nar IGG`CG,CC534PaeR7 IC`TCGA,G264Ehe IGGC|GCC535Xho IC`TCGA,G264Bbe IG,GCGC`C537BamH IG`GATC,C270EcoO109 IRG`GNC,CY780BsaB IGATNN|NNATC275Aat IIG,ACGT`C841Bgl IIA`GATC,T276Ssp IAAT|ATT955Xcm ICCANNNN,N`NNNNTGG289Xmn IGAANN|NNTTC1160Tth111 IGACN`N,NGTC293Bsp1286 IG,DGCH`C1177Not IGC`GGCC,GC305Sca IAGT|ACT1279Eag IC`GGCC,G305EcoN ICCTNN`N,NNAGG1399Xma IIIC`GGCC,G305Cfr10 IR`CCGG,Y1675Dsa IC`CRYG,G312Bsa IGGTCTC 7/111694Nco IC`CATG,G312Ahd IGACNN,N`NNGTC1760Sty IC`CWWG,G312AlwN ICAG,NNN`CTG2239EcoR VGAT|ATC320Afl IIIA`CRYG,T2648Cla IAT`CG,AT325Sap IGCTCTTC 8/112765

pUCm-T载体的全序列信息: D2006 pUCm-T vector-seq.txt
pUCm-T载体是在pUC19载体的基础上改造而成,除多克隆位点外,其余序列同pUC19(GenBank Accession Number
M77789)。
少量自连的载体转化得到的克隆由于编码了LacZ基因,而在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。大部分重组的载体,由于插入片段破坏了LacZ基因,因而在IPTG/X-Gal平板上转化得到白色克隆。这样就可以通过蓝白斑非常容易地筛选出重组克隆,蓝白斑筛选结果示意图如图2。

pUCm-T载体(D2006) 图2. pUCm-T载体的蓝白斑筛选结果示意图。pUCm-T载体和PCR产物片段进行连接,转化后在IPTG/X-Gal平板的上长出的克隆,其中白色克隆代表PCR产物片段可能插入到pUCm-T载体中,但后续还需要酶切、PCR或者测序确认。

对于重组的质粒可以使用载体多克隆位点上的两个PstI酶切位点进行PstI单酶切鉴定,也可以使用廉价且高效的EcoRI、
BamHI、XbaI、HindIII等内切酶进行双酶切鉴定。
构建完成的质粒可以通过质粒上的正反两个M13引物位点进行测序或通过T7 promoter上的T7引物位点进行测序。
构建完成的质粒可以利用T7 RNA polymerase promoter进行体外转录,用于探针标记等。
一个包装的本载体共可以进行20次连接反应。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D2006 pUCm-T载体 20μl
说明书 1份

保存条件:
-20℃保存。
注意事项:
本质粒未经上海金畔生物科技有限公司书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
DNA聚合酶是否可以在PCR产物3’端加A需参考该DNA聚合酶的说明。对于PCR产物为平端的情况,不适合用于T载体的连接反应。对于平端的PCR产物可以先进行在3’端加A的反应,再用T载体进行克隆。
进行PCR产物克隆时需自备连接、转化等相关试剂、试剂盒。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

使用说明:
1. PCR产物纯化:
a. PCR产物可以通过PCR纯化试剂盒或凝胶回收试剂盒(例如上海金畔生物科技有限公司生产的D0033 PCR纯化试剂盒或D0056 DNA凝胶回收试剂盒)进行PCR产物纯化。对于PCR产物条带不是非常单一的情况,宜采用电泳后DNA凝胶回收的纯化方法,这样可以去除PCR扩增出来的非特异性条带的干扰。
2. 连接反应:
a. 对于常规的DNA ligase连接反应,请参考下面的连接反应体系,或按DNA ligase的说明书进行操作。每个连接反应使用1微升pUCm-T载体,约0.2pmol PCR产物,在20微升连接体系中16℃连接过夜。

Sterilized Water ?μl
T4 DNA Ligase Buffer (10X) 2μl
Purified PCR Product ??μl
pUCm-T Vector 1μl
T4 DNA Ligase (5-10U/μl) 1μl
总体积 20μl

b. 对于快速连接试剂盒,请参考相应说明书进行连接反应。pUCm-T 载体的用量还是为1微升,PCR产物的推荐用量约为
0.2pmol。实际做连接反应时对PCR产物的使用量没有必要严格定量,根据PCR产物的亮度大致加入适量的PCR产物进行连接反应即可获得比较理想的连接效果。连接反应中使用的水尽量使用Milli-Q级纯水,或使用双蒸水或三蒸水。
3. 转化和筛选阳性克隆:
按照常规方法进行转化和蓝白斑筛选。转化可以采用上海金畔生物科技有限公司生产的D0302 超级感受态细菌制备试剂盒。蓝白斑筛选所需的IPTG(ST098)和X-Gal(ST912)可以向上海金畔生物科技有限公司购买。对于白斑可以进行酶切鉴定,通常酶切鉴定正确后可以进行测序鉴定。

相关产品:

产品编号 产品名称 包装
D2006 pUCm-T载体 20次
D0033 PCR/DNA纯化试剂盒 50次
D0056 DNA凝胶回收试剂盒 50次
D0302 超级感受态细菌制备试 剂盒 100次
ST097 IPTG 1g
ST098 IPTG 5g
ST912 X-Gal 100mg

产品图片

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