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图解blast验证引物教程

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    图解blast验证引物教程
                  ——以文献报道的人类的ABCG2的引物为例
                    
1、 进入网页：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
2、 点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项
3、 完成2操作后就进入了Basic Local Alignment Search Tool界面
（1）在Enter Query Sequence栏中输入引物序列：
       注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
简便的做法是同时输入上下游引物。输入上下游引物系列都从5’— 3’。 输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物，如下图：
（2）在Choose Search Set栏中：
      Database根据预操作基因的种属定了，本引物可选Human genomic + transcript或Others （nr etc.）。本人倾向于选后者，觉得此库信息更多。如下图：
 
（3）在Program Selection中：选择Somewhat similar sequences （blastn）项，如下图：
 
（4）在此界面zui下面：如下图
Show results in a new window项是显示界面的形式，可选可不选，在此我们选上了。关键要点击Algorithm parameters参数设置，进入参数设置界面。
 
4. 参数设置：
   （1）在General Parameters中：Expect thresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Word size的下拉框将数字改为7。如下图：
 
 
（2）Scoring Parameters无须修改
（3）Filters and Masking中，一般来说也没有必要改
 
5．点击zui下面一栏的BLAST按钮，如图：
 
6.点击BLAST按钮后，跳转出现如下界面：
 
7. 等待若干秒之后，自动跳转出现显示BLAST结果的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。
（1）图形格式：
 
 

简并引物设计方法（实际操作步骤）

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http://www.genecool.com/?fromuid=102401

自己做过一些简并引物，现将我利用生物信息学资源设计简并引物的各个步骤作一个总结，各位战友可将各自的心得体会写下，以便大家交流！！！

一、利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列
因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp（通过蛋白查蛋白），在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。
二、对所找到的序列进行多序列比对
将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W，也可在线分析[url][/url]http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 。其结果入下图所示,所有序列的共有部分将会显示出来。“*”表示保守，“：”表示次保守。

三、确定合适的保守区域
设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～ 400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，zui重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。zui终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。
四、利用软件设计引物
当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中pp5支持简并引物的设计（关于其的使用请见笔者的另一个帖子http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=8798113&sty=1），将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差以个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T），该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。
五、对引物的修饰
若得到的引物为：
5-NAGSGNGCDTTANCABK-3
则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度多高不利于pcr。我们可以通过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库我以前发过大家搜索一下把）。
zui后，这样子设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。

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