探针法支原体检测试剂盒说明书

产品详情

产品描述

《探针法支原体检测试剂盒》具有支原体识别率、最高的检测灵敏度、最高的检测正确率、含内参对照 从而可以区分真阴性样品和假阴性样品等一系列优点，该方法被认为是支原体快速检测的金标准。如果您实验室 已经拥有（或者打算购买）荧光定量 PCR 仪，我们强烈推荐您选择《探针法支原体检测试剂盒》。

经测试，本公司开发的《探针法支原体检测试剂盒》至少可以识别在体外细胞培养中曾经报道出现的 20 种支 原体，根据文献报道，这些支原体基本上占污染细胞的支原体种类。具体如下：（1）M. hyorhinis、（2） M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、 （20）Ureaplasma urealyticum（注：M.为 Mycoplasma 的缩写；A.为 Acholeplasma 的缩写）。

根据支原体 DNA 的 序列，本试剂盒可以识别 100 多种至今已发现的支原体，具有广谱的识别能力。

产品组分

（1） 探针法溶液 1P：550 μL（50 次），含支原体和内参检测用引物及荧光探针;

（2） 探针法溶液 2T：50 μL（50 次），酶溶液;

（3） 内参质粒 mycoIC2：500 μL;

（4） 去离子水：1.2 mL；

（5） 阳性支原体 DNA：50 μL。

使用方法

使用方法

待测样品的前处理 为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品需要取自换液后培养 2-3 天且汇合度在 90% 左右的细胞培养液上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，让细胞生长 2-3 天再取培养液进行检 测。可以按照以下两种方法之一进行样品的前处理： 方法一：对样品进行支原体 DNA 的提取。 很多样品（比如：培养很多天的细胞上清、血清、血浆等）由于含有抑制 PCR 扩增的成分，如果样品不进行 前处理而直接检测，有可能导致 qPCR 扩增失败（qPCR 结果：支原体通道和内参对照通道均无扩增曲线）。该类样品建议客户进行样品 DNA 提取（或者离心清洗，见后文方法二）后，再进行检测。提取 DNA 的过程有两个作用：

（1）基本可以去除所有抑制 PCR 扩增的成分，保证后续定量 PCR 扩增的正常进行；

（2）具有浓缩支原体 DNA 的作用，可以提高相对检测灵敏度 10-100 倍。 样品 DNA 的提取推荐使用本公司的《支原体基因组 DNA 提取试剂盒》。不同样品支原体基因组 DNA 的提取步骤，请参考本公司的《支原体基因组 DNA 提取试剂盒》的说明书。

方法二：样品不经 DNA 提取（推荐方法。该方法不仅可以浓缩支原体从而提高相对检测灵敏度，还可以去 除绝大部分可能的抑制物，PCR 扩增被抑制的可能性极低。如果该简单一步离心清洗的方法仍然无法去除抑制 物，可以使用后文注意事项部分的三步离心清洗的方法。），具体方法如下：

（1）根据浓缩倍数，可以取 100 – 1500 μL 上述待测样品到 1.5 mL 离心管内，在普通台式离心机上 1000 rpm (大约 150 g)低速离心 5 minutes，将离心后的上清转移到另一个离心管内，丢弃细胞沉淀。

（2）将上清继续 13000 rpm（约 16000 g）高速离心 5 minutes，小心吸走全部上清（为避免碰到底部沉 淀，可以保留底部 3-5 μL 液体），用 50μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（样品可以长期保存。推荐）或者去 离子水（样品比较不稳定，只适合当天或短期内检测使用）重悬沉淀（沉淀中含有支原体），吹吸均匀【如果最初使用了 1500 μL 的样品，则支原体浓度大约提高了 30 倍】。

（3）往 50 μL 重悬后的样品中加入 4 μL 内参质粒 mycoIC2【内参质粒融化后，请混匀后再吸取】。

（4）至此，该样品可以直接进行检测，也可以进行热处理后再检测（热处理后，样品保存更稳定）。热 处理具体如下：95 ℃加热处理 5 minutes（可以转移到 PCR 管内，在 PCR 仪上进行加热处理），简单离心 （1000 g，5 seconds）后，取上清进行检测。 

实验案例分析

阳性对照管：其 FAM 通道有典型的 S 型扩增曲线（即指数扩增），其 VIC 通道的扩增线呈直线或者S型曲线。

阴性对照管：其 FAM 通道的扩增线呈直线，其 VIC 通道应该有典型的 S 型扩增曲线。

如果阳性对照管、阴性对照管同时满足上述条件，则说明本次实验结果有效，否则实验结果无效。典型的阴性直线型扩增线和阳性 S 型扩增曲线如图 1 所示：

图 1. 典型的阴性直线型扩增线（左）和阳性 S 型扩增曲线（右）

注意事项

1. 实验全过程，应该佩戴一次性手套操作。

2. 如果出现qPCR的扩增被细胞的代谢产物抑制时（qPCR 结果：支原体通道和内参对照通道均无扩增曲线）， 可以采取以下几种措施：

1) 将取样的时间提前到换液后 2 天或 3 天，此时细胞上清的 PCR 扩增抑制物相对比较少，一般不会产生严重的抑制。据我们测试，换液后 5 天，PCR 扩增抑制物就已经大量积累。

2) 用 PBS 对待测样品进行离心清洗，去除样品中的抑制物。具体方法如下：取 1 mL 细胞上清，先 13000 rpm 离心 5 minutes，吸走 950 μL 上清；加 PBS 950 μL，再次离心，吸走 950 μL 上清；再加 PBS 950 μL， 第三次离心，小心吸走全部上清（为避免碰到底部沉淀，可以保留底部 3-5 μL 液体），用 50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重悬沉淀，95 ℃加热处理 5 minutes，简单离心（1000 g，5 seconds）后，取上清进行检测。但是该方法有如下缺点：第一，如果样品支原体含量较少，离心清洗可能导致漏检，因为离心清洗过程中，可能导致支原体部分丢失。第二，个别样品，即使经过上述清洗也无法去除抑制剂。

3) 使用支原体基因组 DNA 抽提试剂盒（推荐使用本公司《支原体基因组 DNA 提取试剂盒》），抽提细胞上清的支原体 DNA 后再进行 PCR 鉴定。

4) 使用本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》或者《发光法支原体检测试剂盒》进行检测，经测试，未发现这两种试剂盒会被细胞的代谢产物所抑制。

为了预防 PCR 的扩增被细胞的代谢产物抑制的问题，也可以考虑将所有待测样品全部进行离心清洗或者DNA 提取后，再使用本试剂盒进行检测。

3. 支原体检测样品可以分成两类：第一类，用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液，由于该条件非常适合支原体生长，培养数天后，支原体密度一般较高，可达10^7-9/mL，可以直接检测。第二类，低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品，由于这些样品即使有支原体污染，支原体含量一般很少，直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测，往往检测不出来。这些样品建议：

（1）对样品的支原体进行离心浓缩或者使用本公司《支原体基因组 DNA 提取试剂盒》将支原体 DNA 浓缩提取，该两种方法大约可以将检测灵敏度继续提高 10-100 倍。该方法速度快，当天出结果，但是可靠性不如后面的培养法。

（2）使用支原体液体培养基（必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基）培养3-7 天后，再进行检测。具体方法请参考本公司《发光法支原体检测试剂盒》说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢，需要 3-7 天，但是可靠性高。