原核表达载体现货供应
简要描述:启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达*的重要调控序列。没有启动子,基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。
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原核表达载体指:能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。
编辑本段原核表达载体调控原件
1.启动子
启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达*的重要调控序列。没有启动子,基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区。来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使*和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA链。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。
2. SD序列
1974年Shine和Dalgarno首先发现,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3~9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列,简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一,某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合,从而影响蛋白质的翻译。另外,真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后,才能产生一个完整的蛋白质。
3.终止子
在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3’末端往往有特定的核苷酸序列,且具有终止转录功能,这一序列称之为转录终止子,简称终止子(terminator)。转录终止过程包括:RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进,RNA的延伸也停止在终止信号上,完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点,即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域,G/C富含区域又具有回文对称结构。这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构,并且有与A/T富含区对应的一串U。转录终止的机制较为复杂,并且结论尚不统一。但在构建表达载体时,为了稳定载体系统,防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性,一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。
编辑本段原核表达载体构建
1.获得目的基因
(1)通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
(2)通过RT-PCR方法:提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA*链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
2.构建重组表达载体
(1)载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
(2)PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
3. 获得含重组表达质粒的表达菌种
(1) 将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
(2)测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
(3) 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
1. pET系列载体 |
1. pET系列载体 |
78-pet-5a |
pET-5a |
2ug |
78-pet11a |
pET11a |
2ug |
78-pet-11b |
pET-11b |
2ug |
78-pet-11c |
pET-11c |
2ug |
78-pet-15b |
pET-15b |
2ug |
78-pet-16b(+) |
pET-16b(+) |
2ug |
78-pet17b |
pET17b |
2ug |
78-pet-19b |
pET-19b |
2ug |
78-pet-20b(+) |
pET-20b(+) |
2ug |
78-pet21a(+) |
pET21a(+) |
2ug |
78-pet-21b |
pET-21b |
2ug |
78-pet-21d(+) |
pET-21d(+) |
2ug |
78-pet-22b |
pET-22b |
2ug |
78-pet-23a(+) |
pET-23a(+) |
2ug |
78-pet-24 |
pET-24 |
2ug |
78-pet24a(+) |
pET24a(+) |
2ug |
78-pet24-b |
pET24-b |
2ug |
78-pet-25b(+) |
pET-25b(+) |
2ug |
78-pet26b |
pET26b |
2ug |
78-pet27-b |
pET27-b |
2ug |
78-pet-28a |
pET-28a |
2ug |
78-pet-28b |
pET-28b |
2ug |
78-pet-28c |
pET-28c |
2ug |
78-pet29a |
pET29a |
2ug |
78-pet-29b |
pET-29b |
2ug |
78-pet-30a |
pET-30a |
2ug |
78-pet-30b |
pET-30b |
2ug |
78-pet-30c |
pET-30c |
2ug |
78-pet-32a |
pET-32a |
2ug |
78-pet32(+)c |
pET32(+)c |
2ug |
78-pet-32b |
PET-32b |
2ug |
78-pet35b(+) |
pET35b(+) |
2ug |
78-pet38b(+) |
pET38b(+) |
2ug |
78-pet-39b |
pET-39b |
2ug |
78-pet-3a |
pET-3a |
2ug |
78-pet-40b(+) |
pET-40b(+) |
2ug |
78-pet-41a |
pET-41a |
2ug |
78-pet-42a(+) |
pET-42a(+) |
2ug |
78-pet-42b |
pET-42b |
2ug |
78-pet-43a |
pET-43a |
2ug |
78-pet-43b |
pET-43b |
2ug |
78-pet-49b(+) |
pET-49b(+) |
2ug |
78-PET-31b(+) |
ET31b(+) |
2ug |
78-pet-41b(+) |
pET-41b(+) |
2ug |
78-pet41Ek-Lic |
pET41Ek-Lic |
2ug |
2. PTYB 系列载体 |
2. PTYB 系列载体 |
78-TYB1 |
TYB1 |
2ug |
78-TYB2 |
TYB2 |
2ug |
78-TYB11 |
TYB11 |
2ug |
78-TYB12 |
TYB12 |
2ug |
3. pGEX系列载体 |
3. pGEX系列载体 |
78-pGEX-4T-1 |
pGEX-4T-1 |
2ug |
78-pGEX-4T-2 |
pGEX-4T-2 |
2ug |
78-pGEX-6P-1 |
pGEX-6P-1 |
2ug |
78-pGEX-20T |
pGEX-20T |
2ug |
78-pGEX-4T-3 |
pGEX-4T-3 |
2ug |
78-pGEX-6P-2 |
pGEX-6P-2 |
2ug |
78-pGEX-5X-1 |
pGEX-5X-1 |
2ug |
78-pGEX-2TK |
pGEX-2TK |
2ug |
78-pGEX |
pGEX |
2ug |
78-pGEX-KG |
pGEX-KG |
2ug |
4. pBAD系列载体 |
4. pBAD系列载体 |
78-pBAD24 |
pBAD24 |
2ug |
78-pBAD43 |
pBAD43 |
2ug |
78-pBADHis A |
pBADHis A |
2ug |
78-pBADHisB |
pBADHisB |
2ug |
78-pBADHisC |
pBADHisC |
2ug |
5.原核融合表达载体 |
5.原核融合表达载体 |
78-PProEX-HTa |
pProEX-HTa |
2ug |
78-PProEX-HTb |
pProEX-HTb |
2ug |
78-PProEX-HTc |
pProEX-HTc |
2ug |
78-PMAL-c4x |
pMAL-c4x |
2ug |
78-PEYFP-mem |
pEYFP-mem |
2ug |
78-PEXP1-DEST |
pEXP1-DEST |
2ug |
6. 其他载体 |
78-Pbv220 |
pbv220 |
2ug |
78-PET-DsbA |
pET-DsbA |
2ug |
78-PET-GST |
pET-GST |
2ug |
78-PET-His |
pET-His |
2ug |
78-KD3 |
KD3 |
2ug |
78-PLLP-Om78-PA |
pLLP-OmpA |
2ug |
78-PLLP-STII |
pLLP-STII |
2ug |
78-PMAL-C2X |
pMAL-C2X |
2ug |
78-PMAL-P2X |
pMAL-P2X |
2ug |
78-PMBP-P |
pMBP-P |
2ug |
78-PQE30 |
pQE30 |
2ug |
78-PQE31 |
pQE31 |
2ug |
78-PQE-32 |
pQE-32 |
2ug |
78-PRSET C |
pRSET C |
2ug |
78-PRSET-A/B |
pRSET-A/B |
2ug |
78-PTH-304-18Z |
pTH-304-18Z |
2ug |
78-PTrcHis B |
pTrcHis B |
2ug |
78-PTrcHis C |
pTrcHis C |
2ug |
78-PTrcHisA |
pTrcHisA |
2ug |
78-PTrxFus |
pTrxFus |
2ug |
78-PTWIN1 |
pTWIN1 |
2ug |
78-PG-KJE8 |
pG-KJE8 |
2ug |
78-PGro7 |
pGro7 |
2ug |
78-PKJE7 |
pKJE7 |
2ug |
78-PG-Tf2 |
pG-Tf2 |
2ug |
78-PTf16 |
pTf16 |
2ug |
78-PQE40 |
pQE40 |
2ug |
78-PCMV-myc |
pCMV-myc |
2ug |
78-PQE80 |
pQE80 |
2ug |
78-PSE380 |
pSE380 |
2ug |
78-PQE-9 |
pQE-9 |
2ug |
78-PQE-60 |
pQE-60 |
2ug |
78-PQE-70 |
pQE-70 |
2ug |
78-PTWIN2 |
pTWIN2 |
2ug |
78-PCFS119 |
PCFS119 |
2ug |
78-PVSV-G |
pVSV-G |
2ug |
78-PCDFDuet-1 |
pCDFDuet-1 |
2ug |
78-PSecTag2 HygroA |
pSecTag2 HygroA |
2ug |