worthington磷酸酶
磷酸酶，碱性测定
分析（鸡肠酶）
方法：磷酸酶活性的测定是基于Brandenberger和Hanson（1953）和Hofstee（1954）的工作。确定了该酶对邻羧基苯基磷酸酯的初始水解速率的催化作用。与磷酸酯不同，水杨酸大吸收约300 nm的光。因此水解率可以通过吸光度的增加来确定。在规定的条件下，一个单元在25°C和pH 8.8下每分钟水解一微摩尔的邻羧基苯基磷酸酯。
试剂种类
- 0.1 M Tris·HCl，pH 8.5
- 0.2 M甘氨酸，pH 8.8
- 0.05 M氯化镁
- 3.65 mM邻羧基磷酸苯酯（OCPP）
酵素
以1 mg / ml的浓度溶于0.1 M Tris-HCl，pH 8.5（原液）中。活化后可能需要进一步稀释。
程序
通过在25°C水浴中将mg / ml溶液孵育20-30分钟来激活酶。
将分光光度计调节至300 nm和25°C。
移液到每个比色皿中，如下所示：
| 0.2 M甘氨酸，pH 8.8 |
2.0毫升 |
| 3.65毫米OCPP |
1.0毫升 |
| 0.05 M氯化镁2 |
0.5毫升 |
在分光光度计中于25°C孵育3-4分钟，以达到温度平衡并确定空白速率（如果有）。加入0.1 ml的原液并记录从曲线的初始线性部分增加A / 300。
计算方式
分析（大肠杆菌酶）
方法：该方法是Garen和Levinthal（1960）的方法，其中通过测量由对硝基苯基磷酸酯水解为对硝基苯酚而导致的410 nm吸光度的增加来确定反应速度。在规定的条件下，一个单元在25℃，pH 8下每分钟释放一微摩尔对硝基苯酚。
试剂种类
- 1.5 MTris⋅HCl缓冲液，pH 8.0
- 0.003 M对硝基苯基磷酸酯（PNP）。必须谨慎使用分析级和正确的分子量。
酵素
在试剂级水中稀释，以获得0.02-0.04ΔA/分钟的速率。
程序
将分光光度计调节至410 nm和25°C。
移液到每个比色皿中，如下所示：
| PNP 0.003百万 |
1.0毫升 |
| 1.5 M Tris·HCl，pH 8.0 |
2.0毫升 |
充分混合并在分光光度计中孵育4-5分钟，以达到温度平衡并确定空白率（如果有）。加入0.1毫升稀释的酶并记录。从曲线的线性部分确定3-5分钟的A 410。
计算方式
分析（小肠酶）
方法：在37°C，pH 9.8下，每分钟可水解1 umole的对硝基苯酚磷酸酯。
试剂种类
- 1.0 M二乙醇胺和0.05 mM MgCl 2缓冲液，pH 9.8：用试剂级水稀释12.4 gm二乙醇胺（85％）。加入0.05 ml MgCl 2溶液（见下文），并用HCl将pH调节至9.8（在37°C下）。用试剂级的水调节至100 ml。
- MgCl 2溶液：将20.3 g MgCl2°6 H2O溶于100 ml试剂级的水中。
- 0.67 M磷酸对硝基苯酯溶液：将250 mg磷酸对硝基苯酯钠盐溶于1.0 ml试剂级的水中。
- 稀释剂：0.1 M TEA·HCl。将1.86克TEA·HCl溶于试剂级的水中，添加0.1毫升MgCl 2溶液和0.1毫升0.1 M ZnCl 2，用NaOH调节pH到7.6，然后用试剂级的水调节到100毫升。
酵素
使用稀释剂获得大约0.05-0.06 u / ml。在室温下静置15-20分钟。
程序
将分光光度计调节至405 nm和37°C。
移液到试管中：
| |
测试 |
空白 |
| 缓冲 |
3.00毫升 |
3.00毫升 |
| 磷酸4-硝基苯酯 |
0.050毫升 |
0.050毫升 |
| 混合并保温以达到温度平衡。 |
| 冲淡 |
—— |
0.050毫升 |
| 样品 |
0.050毫升 |
—— |
混合。测量吸光度的变化，并根据曲线的线性范围计算ΔA/ min。
计算方式
