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CRISPR-Cas9的改良技术
— 细胞特异性敲除与miNRA-Cas9开关
近日，日本实验室发表了有关miRNA-Cas9开关与细胞特异性敲除的报告，他们将Trilink的修饰NTPs 结合到定制的Cas9 mRNA中，用于优化CRISPR Cas9 基因编辑在细胞特异性中的应用。
目前，以DNA为基础的基因编辑发展迅速，尤其是CAR-T疗法（Novartis’ Kymriah 和 Gilead’s Yescarta）。但在某些应用程序中，成功的限制性因素在于其以细胞类型*的方式运作的能力。研究小组选择了一种基于RNA的传递系统，以克服一些以DNA为基础的系统相关的安全问题，包括基因组整合系统的安全问题等。
研究报道：为了调控Cas9的核酸内切酶活性，已有几种方法，包括光或小分子蛋白诱导系统、组织特异性启动子系统，和采用split-cas9的转录调节电路。但这些报导主要都是使用DNA传递方法。
该研究团队设计了一个基于mRNA的Cas9开关，该开关是由具细胞特异性的microRNA（miRNA）调控。具体来说，他们引进了miRNA的互补序列到Cas9 mRNA的5'端非编码区（见图1），假设通过检测异质性细胞内的内源性miRNA水平，可以选择性地控制基因组编辑。当靶基因miRNA缺乏时，Cas9蛋白被翻译表达，当靶基因miRNA存在时，该蛋白翻译表达被抑制。
研究报告显示，他们miRNA-cas9开关有效地和选择性地响应了HeLa细胞中的miRNA。同时，使用不同的标记mRNA，在人类诱导多能干细胞（hiPSCs）中都可看到类似的结果。
另外，使得惊喜的是，此系统也能够区分诱导和分化的神经元细胞胞，此功能可能将在临床应用中起重要作用。
同时，为进一步优化相关领域，他们提出，可通过含有多个miRNA开关的Cas9系统实现，例如减少泄漏表达等。
研究小组得出结论：系统应适用于其他Cas9变异（例如同源基因工程蛋白Cas9 / dCas9）和其他miRNA的即插即用方式。”这个功能和易用性可以很好地改良CRISPR-Cas9技术。
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