标签归档：使用

polysciences 24765 配制使用说明书

发表于由

世界*实验材料供应商 Polysciences上海金畔生物为其中国代理， Polysciences在一直是行业的*,一直为广大科研客户提供产品和服务,上海金畔生物一直秉承为中国科研客户带来的产品，的服务， Polysciences就是为了给广大科研客户带来更加完善的产品和服务,您的满意将是我们的收获

Polysciences中国代理, Polysciences上海代理， Polysciences北京代理，Polysciences广东代理，Polysciences江苏代理Polysciences湖北代理,Polysciences天津,Polysciences黑龙江代理,Polysciences内蒙古代理,Polysciences吉林代理,Polysciences福建代理, Polysciences江苏代理, Polysciences浙江代理,Polysciences四川代理,

 

美国POLYSCIENCES公司成立于1961年，主要生产和经营LIFE SCIENCES生命科学（胶体金,不含甲醛的甲醇等），病理学和显镜学 微球和粒子和磁珠各种单体和聚体等产品。polysciences公司是多聚化合物供应商,同时是世界*的免疫学,组织化学试剂耗材供应商.

 

 

转染试剂线性PEI MAX溶液的配制

线性聚乙烯亚胺盐酸盐(Linear Polyethylenimine Hydrochloride)是线性化聚乙烯亚胺PEI 25,000的升级产品，是一种功能更为强大的瞬时转染试剂。与PEI 25000的区别在于：1）*水解（去乙酰化）2）PEI 25000的盐酸盐形式，具更高的水溶特性 3）含更长连续性乙烯亚胺片段，其质子化氮水平比PEI25000提高11%以上。

另PEI MAX 40K比PEI 25K更易于使用，并且更。PEI 25K转染溶液通常需要几个小时才能制备，而PEI MAX 40K可以在两个小时内转化为即用型溶液。而且PEI 25K含有4-11%的残余丙酰基，可防止聚合物主链与DNA强烈结合。PEI MAX 40K*去乙酰化的结构意味着每批产品的表现始终如一。

下面将主要介绍polysciences 线性PEI MAX(#24765)的产品特性及其溶液的配制过程。

1.产品特性:

产品名称：转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐(PEI MAX)(Linear Polyethylenimine Hydrochloride)

CAS号

 49553-93-7

分子式

(C2H5N)n ● xHCl

分子量

40000

外观

白色或灰白色自由流动固体

储存

室温

结构式

 

溶解性

溶于低温和室温水；不溶于常用有机溶剂（乙醇，丙酮，

 

2.溶液配制

此指导说明书是经polysciences公司研究，测试及其客户反馈的后编写的。下面推荐一种简单适用而的方法，讲述如何配制浓度为1mg/mL的转染试剂的配制。

材料：

1g #24765、1L 纯水（Milli-Q®纯水，注射用水（WFI），或类似的生物级水）、1N氢氧化钠、25mL无菌塑料吸管、一次性0.1µm, 0.2µm, 0.22µm PES真空无菌过滤器、无菌高聚乙烯或聚丙烯试剂瓶。

器材：

1 L 玻璃烧杯、1 L玻璃量筒、pH计、移液器、磁力搅拌棒、带油管的真空泵

配制过程：

1g #24765——900mL水溶解——搅拌、加热（60-80°C）——加1N NaOH调pH到6.9-7.1——移液到量筒，加水补足至1L——真空过滤消毒——分装，4°C保存。

备注：加热或加酸都有助于PEI溶解。#24765比#23966易溶，可适当少量加酸，详细用量可试加一点搅拌看看，足够溶解就行，不一定需要加到pH那么低。

 

 

货号

品名

规格

品牌

24765-1

Polyethylenimine “Max”, (nominally Mw 40,000*)

1g

polysciences

 

 

 

我们公司优势是强大的采购，

1：基本什么都能进口，血清，抗体，耗材，还有部分限制进口的，

2：货品全，现经营过700多个品牌，基本所有生物试剂耗材都可以进口，特别是冷偏的产品那就更有优势，

3：提供加急服务，一般1-2周到货，超过时限加急费全免

4：价格公道，绝大部分价格有优势，当然不能保证100%产品都是价格低,因为价格低意味着没有服务.

5：良好的信誉，大部分客户我们提供货到付款服务，客户包括清华，北大 交大 复旦，中山等100多所大学，ROCHE，阿斯利康，国药 ，fisher等500多家公司

6：我们*代理的品牌有：Antibody Research Corporation，arcticzymes，Biorelevant，AmberGen, Inc. ，clemente-associates，clodronaiposomes，Columbia Biosciences，enzyme research，Gene Bridges GmbH，Genovis，AmberGen, Inc.  Biotechnology GmbH，Haematologic Technologies HTI Haemtech，hookelabs，Immudex，Innovative Research of America，inspiralis ，List Biological Laboratories, Inc.，lumafluor，Microsurfaces，multiplicom，nanotools，Pel-Freez Biologicals，pentapharm，progen，Protein Ark，QA-Bio,Inc，QA-Bio,IncQuickZyme Biosciences，Teknova，TriLink BioTechnologies, Inc.，Zyagen Laboratories 等

7：我们还是invitrogen,qiagen,Midland BioProducts Corporationam,sigma;neb,roche,merck, rnd,BD, GE,pierce,BioLegend等知名*批发，欢迎合作。

Quickzyme QZBtotcol1现货使用说明书

发表于由

QuickZyme Biosciences是一家创新的生命科学公司，为研究界提供新颖*的产品，这些产品在基质相关蛋白，酶和测定法领域具有附加值。

 

上海金畔生物Quickzyme QZBtotcol1现货使用说明书

 

介绍

胶原是细胞外基质的主要成分之一。胶原生成的失调会导致纤维化（过多的胶原）或骨关节炎（过少的胶原）等病理变化。

因此，在许多情况下，胶原蛋白的测定是很重要的

疾病相关研究。

quickzyme总胶原测定是基于羟脯氨酸的检测。羟脯氨酸是一种非蛋白性氨基酸，存在于哺乳动物的弹性蛋白和胶原蛋白中。它的存在主要局限于胶原的三螺旋，在那里它的存在增加了三螺旋的稳定性。羟脯氨酸是在脯氨酸羟化酶的作用下由特定的脯氨酸残基翻译后形成的。组织水解物中的羟脯氨酸可以直接测量胶原蛋白的含量。

胶原的测定是从组织样品在95oC的6M HCl中*水解开始的。水解产物中的羟脯氨酸残基通过对prockop和udenfriend（anal）所述方法的改进进行定量。Biochem.，1960，1:228-239）。该分析测量了样品中羟脯氨酸的总量，它代表了样品中存在的所有类型的胶原，而不区分胶原类型和前胶原、成熟胶原和胶原降解。

产品

该测定是简单的，并且结果在570 nm处具有大的吸光度。这种分析方法的发展使得它不需要酸水解后的干燥步骤，而酸水解通常需要特殊的设备。

Total Collagen Assay

总胶原测定

 

总胶原蛋白测定试剂盒基于对胶原蛋白进行酸水解而获得的羟脯氨酸残留的定量比色测定。通常，对于该分析，需要水解除去HCl，这是一个耗时的步骤，并且/或者需要特殊的设备。QuickZyme总胶原蛋白测定法是仅有不需要此繁琐步骤的基于羟脯氨酸的测定法，可在水解步骤后进行快速（<2小时）且简便（96孔板形式）的测定。

胶原蛋白测定总规格

  • 定量测量所有类型的胶原蛋白，种类无关。
  • 样品：细胞提取物，组织匀浆，组织。
  • 比色法测定羟脯氨酸含量
  • 范围：6至300μg/ ml。灵敏度：2.5 µg / ml
  • 以鼠尾胶原蛋白为标准
  • 易用性：相当于ELISA
  • 室温保存

价格/产品编号-订单

One 96 well plate kit  
Two 96 well plate kits  .
Five plate bulk kit          。		 325欧元     。
615欧元     。
€1217   。		 QZBtotcol1
QZBtotcol2 
QZBtotcol5

各种胶原的定量测定

•与物种无关

•570 nm下的比色读出

•快速简便

•动态范围广

•基于羟脯氨酸的分析

•独立于提取方法

•无需特殊设备！

 

分析规格

动态范围：6-300微克/毫升

灵敏度：2.5微克/毫升

样品体积：50-500微升

格式：96孔板

用途：非常广泛的应用：条件培养基

细胞/细胞提取物组织/组织提取物物种无关胶原类型无关

盒子里有什么？

包括标准、缓冲器和板。水解管，微量板，胶原蛋白标准品，缓冲液，检测试剂，板封。不包括盐酸。

其他所需材料

需要但不提供以下材料和设备：

•12M和6M HCl用于样品水解

•4M HCl用于样品和标准稀释

•单通道和/或多通道移液管

•Eppendorf离心机

•恒温箱（或温度计或校准烤箱），用于在95摄氏度（不高于！）

•在60℃下加热的培养箱

•可在540至580纳米之间测量波长的微板阅读器，优选570纳米。

•微孔板振动筛

•聚丙烯、聚乙烯或玻璃管（不含聚苯乙烯）

 

定量测量

储存条件

未打开的工具包：

在黑暗中室温（RT）下储存。不要使用超过套件有效期的套件组件。

打开的试剂盒/重组试剂：

打开的胶原蛋白标准品和分析缓冲液应在4℃下避光保存。其他打开的试剂应在室温下避光保存，并至少稳定1个月。重组检测试剂（A+B）应在重组当天使用。

预防措施

该试剂盒含有正丙醇、高氯酸、乙酸和二甲基亚砜。请参阅相关的MSDS:www.quickzyme。。ｃｏｍ/products/total-collagenassay。在2019年1月4日样品水解和使用试剂盒时，在总胶原蛋白分析期间佩戴眼睛、手、脸和衣物保护装置。在通风柜中进行分析。

临界参数

•此类分析可显示基质效应：样品中影响信号的干扰因素。通过稀释水解液可以避免这种影响。如果使用样品类型，应测试各种稀释液，直到获得A570与稀释液的线性。应用说明中给出了几种小鼠组织的建议稀释液（见我们网站上的产品页）。如果对于您的特定样品类型，为避免基质效应所需的稀释导致A570值非常低，我们建议使用

Quickzyme敏感组织胶原试剂盒。

•水解发生在95摄氏度（不高于！）20小时。螺丝帽

管子应该用手紧紧地关上。如果管不严密，水解液将蒸发。

•在分析的后一步中，在60℃下显色的培养时间为1小时。这是基于在烤箱中孵化。当在平板培养箱中进行培养时（培养箱和平板之间紧密接触），缩短的培养时间（20-30分钟）就足够了。

•当将分析缓冲液添加到35μl（稀释）水解液中时，会出现浑浊的外观，在一分钟内消失，不会影响分析。

•在低温下，分析缓冲液可能含有一些晶体。这些可以通过加热溶解。

在室温下，试剂A可能变成凝胶或固体，在37℃加热，涡旋将解决这个问题。

缓冲液/试剂制备

•分析缓冲液已准备好使用

•用于制备检测试剂混合物2体积的检测试剂A和3体积的检测试剂B。

检测试剂B和浓缩试剂A+B可能会腐蚀某些类型的塑料。对于这些溶液的移液，使用聚丙烯或聚乙烯移液管，或玻璃移液管。A+B溶液应在PP、PE或玻璃管中制成。不建议使用聚苯乙烯或PET。

试剂盒中提供的96孔板对分析中存在的稀释A+B溶液具有抗性。检测试剂B和A+B混合物具有腐蚀性，应小心处理。在通风柜中工作，使用适当的眼睛和面部保护，并戴手套。

样品制备（1）

-细胞提取物

将细胞提取物（50–250μl）转移到螺旋盖管中，并用12M HCl（终浓度6M HCl）以1:1（v/v）稀释。建议至少使用50μl样品和50μl 12M HCl。在放入烤箱之前，请将管子关紧。另请参见上面的关键参数。

-组织

a.组织匀浆

组织匀浆的处理与上述条件培养基和细胞提取物的处理类似。

b.组织样本

对组织样品（湿的或干的）进行称重，并将其转移到螺旋盖管中。所需的组织数量高度依赖于组织中的胶原蛋白水平。作为指示，根据组织的类型和数量，添加6M HCl以获得50-300 mg组织/ml。建议小体积为100μl。

样品制备（2）

管子必须非常紧密地闭合（从上面可以很清楚地看到橡胶圈），并在95℃下在校准的烤箱或热块中孵育20小时（不要在更高的温度下孵育）。孵育后，将试管冷却至室温。在达到室温之前不要打开管子。试管在eppendorf离心机中以13000 x g离心10分钟。上清液用于进一步分析。由于脂肪和碳水化合物的降解而产生的棕色或黑色颗粒可能存在，通过离心很难*去除。颗粒的数量取决于样品。转移上清液时尽量避免用移液管移取颗粒。除了挡住光路之外，这些微粒不会干扰分析。

首先用半水稀释水解样品：1体积样品+0.5体积水（例如200微升水解物+100微升水）。样品现在在4M HCl中。可能需要的所有进一步稀释（见“关键参数”中的备注）应使用4M HCl进行。试验中使用35μl稀释水解样品进行分析。

标准制备

胶原蛋白标准品以1200μg/ml的储备量在0.02m醋酸中提供。

对于标准线，将本标准的125μl转移到螺旋盖管中，并与等量（125μl）的12M HCl（6M HCl中的终浓度为600μg/ml）混合。管子非常紧密地闭合（橡胶圈应清晰可见），并在95摄氏度（不高于）下孵育20小时。在经过校准的烤箱或温度计中。孵育后，将试管冷却至室温，并在13000 x g的eppendorf离心机中离心10分钟。

上清液用于进一步分析。将8个Eppendorf管标记为S1-S8。s1至s7为水解料的稀释液，s8为空白。用水和4M HCl进行首轮稀释，以调整至4M HCl浓度。根据以下方案，在4M HCl中进行进一步稀释。结果得到如下标准线：300μg/ml（s1）；200μg/ml（s2）；100μg/ml（s3）；50μg/ml（s4）；25μg/ml（s5）；12.5μg/ml（s6）；6.25μg/ml（s7）；0μg/ml（s8）。稀释后将所有标准品充分混合。每种标准品35μl用于分析

 

胶原蛋白标准线样品制备的移液方案

分析程序

建议对所有样品和标准品进行分析，一式两份

一。按照“样品制备”中的说明制备样品。

2.按照“标准制备”中的说明制备胶原蛋白标准品。

三。用移液管将35微升标准溶液移到分析微孔板的适当孔中。

四。用移液管将35μl稀释的水解未知样品（在4M HCl中）移到适当的孔中。

5个。每孔加入75μl试液，混匀。

6.用一个封闭的胶粘板封条盖住板，在室温下孵育20分钟，同时摇动板。

7。通过检测试剂A和B2:3（RESP 30μL＋45 L L/阱）混合，制备一套足以检测待测威尔斯（75μL/阱）的试剂。

8。小心地拆下板密封件

9。每口井加入75μl检测试剂。

10。用封闭的粘合板密封件盖住板。

11。摇动盘子使之充分混合。在60°C的烘箱中培养60分钟（不要使用更高或更低的温度）。

12。把盘子放在冰上冷却5分钟至室温

13。混合板并小心地拆下板密封件

14。清洁板底部，在570 nm（可接受540-580 nm）下读取板并进行数据分析。

 

数据分析

有几种方法可用于计算分析样品中的胶原蛋白浓度。建议使用回归曲线拟合程序的软件包处理数据。如果不可用，可以手动计算胶原蛋白浓度，如下所示。

-平均每个标准品或样品的重复读数，并从所有读数中减去平均空白。

-通过绘制Y轴上的每个标准的A570（减去空白）与XXAX（0 – 3.13 – 6.25 – 12.5 – 25 – 50 – 100 – 200 – 300μg胶原蛋白/ml水解物）上的胶原含量的标准曲线。通过图形上的点绘制宜拟合线性化曲线。使用此标准曲线将试验样品的A570值转换为μg/ml胶原。这就得到了水解样品中的胶原蛋白浓度。如果水解后包括稀释步骤，则浓度应乘以2019年1月8日的稀释总胶原蛋白含量因子，得出水解样品中的胶原蛋白浓度。根据样品制备，可以计算原始样品中的胶原蛋白量。

典型数据

所示数据曲线仅供演示。准确的a570值在每个实验中可能略有不同。

典型的胶原蛋白标准曲线

 

相关产品：

-Soluble collagen assay 

– Hydroxyproline assay

– Human and mouse MMP-9 activity assay

– Human and mouse MMP-2 activity assay

 

 

 

clodronateliposomes脂质体使用说明书

发表于由

clodronateliposomes脂质体使用说明书

 

产品描述

磷脂双层由磷脂酰胆碱和胆固醇组成。将所有脂质体制剂悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中：

– 10 mM的Na2HPO4；
– 10毫米NaH2PO4；
– 140毫米氯化钠。

我们所有的脂质体均带负电荷，因此不会一起阻塞。悬浮液中的脂质体没有大小，这意味着它也包含越来越大的脂质体（大3微米）。平均而言，脂质体的大小为1.7微米。

氯膦酸盐脂质体：人工制备的脂质囊泡的悬浮液，包裹了氯膦酸盐。悬浮液中氯膦酸盐的浓度约为。5毫克/毫升 氯膦酸盐以CH2Na2Cl2O6P2·5 H2O的形式封装在脂质体囊泡中。

PBS脂质体：人工制备的脂质囊泡的悬浮液，其中包裹了PBS水溶液。这些不含氯膦酸盐，可用于对照实验。

荧光DiI脂质体：人工制备的脂质囊泡的悬浮液，其中包封了PBS水溶液，并用荧光染料DiI标记。它们不含氯膦酸盐，可用于研究通过特定给药途径注射的脂质体是否能够到达要研究的巨噬细胞。

 

储存和使用说明

到达脂质体后，应将其储存在4 – 8ºC（或39 – 47ºF）之间。脂质体悬浮液不得冷冻，也不要暴露于高温下。这可能会对磷脂双层造成干扰，可能导致氯膦酸盐从脂质体中泄漏出来。

给药前，首先使脂质体达到室温，然后轻轻摇动或搅拌悬浮液。一段时间后，脂质体易于沉淀，导致小瓶中的分布不均匀。当注射花费太多时间时，脂质体甚至可能在注射器中沉淀。如果使用同一注射器注射多只动物，可能会导致剂量不同。

不建议稀释悬浮液，但如有必要，请使用PBS或盐水。

我们建议客户在发货后16周内使用脂质体制剂。强烈建议不要在到期日期之后使用。在此期间之后，污染的风险会增加，并且可能会发生轻微的功能丧失。

作用机理

巨噬细胞在免疫和非免疫防御机制中起重要作用。它们是抵御渗透到脊椎动物体内的细菌，病毒和其他形式的微生物污染的首道防线。巨噬细胞是大型细胞，几乎存在于所有身体组织中，它们可以具有不同的形式和名称（例如库普弗细胞，肺泡巨噬细胞，小胶质细胞，破骨细胞，红髓巨噬细胞）。巨噬细胞“清除”，它们摄入并消化可能是潜在病原体的所有异物，微生物，癌细胞和细胞碎片。该过程称为吞噬作用。巨噬细胞主要通过可溶性分子如细胞因子和趋化因子的介导来进一步调节许多非吞噬细胞的功能。他们参与先天免疫，

脂质体是人工制备的球体，由同心磷脂双层组成。当磷脂分散在水中时，亲水性头部将构成脂质体的两个外部部分，而疏水性脂肪酸基团将构成内部部分（见图1）。水室分隔双层，亲水分子可以溶解在其中，形成脂质体包封的分子。氯膦酸盐（二氯亚甲基双膦酸酯或Cl2MBP）是一种亲水性分子，可以封装在磷脂双层中。游离氯膦酸盐不易穿过细胞膜，并通过肾脏系统从循环中迅速清除（即数分钟内）。但是，氯膦酸盐脂质体包埋在脂质体中时，会被巨噬细胞吞噬，无法逃脱（见图2）。磷脂双层被溶酶体磷脂酶消化，而氯膦酸盐未被消化并且保留在巨噬细胞中。巨噬细胞摄入的磷脂双层和脂质体越多，在巨噬细胞内积累的氯膦酸盐越多。超过一定的细胞内浓度，氯膦酸盐将通过启动程序性细胞死亡（即凋亡）来消除巨噬细胞。

图1.氯膦酸盐脂质体的示意图。囊泡由同心的磷脂双层构成，被水性隔室隔开。双层由亲水和疏水基团组成。将氯膦酸盐（在此以黑色方块表示）溶解在水溶液中并封装在脂质体内。

 

图2.巨噬细胞对氯膦酸盐脂质体的摄取和消化示意图。巨噬细胞通过胞吞作用摄入氯膦酸盐脂质体，然后与含有磷脂酶的溶酶体（L）融合（箭头）。磷脂酶破坏的磷脂双层越多，在巨噬细胞内释放的氯膦酸盐（黑色方块）越多。巨噬细胞终通过凋亡被杀死。（N =巨噬细胞核）。

 
因此，氯膦酸盐脂质体可用于通过消耗巨噬细胞来研究巨噬细胞功能。例如，它们可以应用于各种自身免疫性疾病，移植，神经系统疾病和基因治疗的模型。氯膦酸盐脂质体只有在可以达到的情况下才能耗尽巨噬细胞。一些组织可以形成脂质体的屏障。通过选择氯膦酸盐脂质体的正确给药途径，可以耗尽特定的器官或组织的巨噬细胞。有关管理协议的更多信息，请单击此处。

PBS脂质体主要用于对照实验。但是，这些也可以在某些时间段内通过饱和来阻止吞噬作用。因此，PBS脂质体不能代表正常健康的，未阻断的，未抑制的和未活化的巨噬细胞的对照实验。当比较氯膦酸盐脂质体和PBS脂质体的作用时，其作用因此可能小于预期。

有关更多信息，请参见：

– Van Rooijen，N.和Sanders，A.（1994）。脂质体介导的巨噬细胞耗竭：作用机理，脂质体制备和应用。免疫学杂志，174（1-2），83-93。
– Van Rooijen，N.，Sanders，A.和van den Berg，TK（1996）。脂质体介导的氯膦酸盐和丙am的细胞内递送诱导的巨噬细胞凋亡。免疫学杂志，193（1），93-99。

 

无血清培养基使用方法

发表于由

经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。

    无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所 配制的*培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血 清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清 培养基一直是生物科学工作者努力的目标。

无血清培养基的基本配方

基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。

添加组分包括以下几大类物质：

（1）促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白 等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细 胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。

（2）促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞*的，如胰岛素。

（3）酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中*须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。zui常用的是大豆胰酶；抑制剂。

（4）结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。

（5）微量元素：硒是zui常见的。

使用方法

目前，血清仍是动物细胞培养中zui基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以 后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低 过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细 胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生 变化。

为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：
●处于对数生长中期
●>90% 活细胞率
●适应时以较高的起始细胞接种

有两种方法使细胞适应无血清培养基:

1. 直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基中。
一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该:2.5×105~3.5×105细胞/ml。当细胞密度达到 1×106~3×106细胞/ml时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×106~4×106细胞/ml时，细胞*适应了无血清培养基。 每隔3~5天，当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。

2. 连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。
●以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25％SFM 混合培养基中，传代培养。
●当细胞密度>5×105细胞/ml时，以2×105到3×105细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
●以2×106到3×106细胞/ml细胞密度，25％有血清培养基和75% SFM中传代培养。
●当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml（接种后4到6天），在100％SFM培养基中传代培养。
●每隔3到5天，当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。

  在适应过程中，不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因 素的影响。细胞培养适应替代血清：许多细胞利用连续适应方法能很好的适应，用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1（v∶v）的混合培养基 培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培养基。每次适应改变血清比例时，传代细胞 2到3次。培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生 长率恢复到以前的水平。特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基 缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。

无血清培养基的优点
 
●增加确定性
●性能更加一致
●容易进行纯化和下游加工
●细胞功能的评估
●增强生长和/或产量
●生理反应性的较好对照
●增强细胞内中介物的检测

上海金畔生物科技有限公司
：杨建辉
：

*8006

:
:http://www.jinpanbio.com/
上海市浦东新区绣川路561号1102室

Sigma去糖基化试剂盒

发表于由

 

Sigma去糖基化试剂盒

Sigma-Aldrich 的天然蛋白去糖基化试剂盒（Native Protein Deglycosylation Kit，货号NDEGLY）可在天然条件下去除糖蛋白上的N连接寡糖。糖基化蛋白修饰通常位于折叠蛋白中不容易接近的位置，因此在未变性的情况下，不大可 能通过标准的肽N- 糖苷酶 F（PNGase F）处理来去除。如果您的下游分析需要折叠蛋白（如酶学分析或蛋白相互作用分析），那么这个试剂盒也许适合您。

此试剂盒包含了内糖苷酶F1、F2和F3，以及相应的反应缓冲液。与PNGase F相比，这些内糖苷酶对蛋白构象没那么敏感，更适合在蛋白未变性的情况下去除各种N连接寡糖。这三种内糖苷酶有着不同的连接特异性。F1能够去除低聚甘露 糖和混合寡糖结构，而F2和F3则分别能去除两个分支和三个分支的结构。

此试剂盒在去糖基化上的效果如何呢？美国西北大学的博士生A. Caulfield介绍了他的使用心得。

据Caulfield介绍，他们想要确定目的蛋白在去糖基化之后的生物学活性。糖基化的 去除可通过Western blot来评估，即蛋白条带的分子量减少。他们的目的蛋白包含N连接糖基化。此蛋白在HEK 293细胞中产生，并利用其N端的FLAG标签来纯化。之前他们试过PNGase，但无法让目的蛋白去糖基化。

在这一实验中，他们将2 ug目的蛋白与0.02个单位的内糖苷酶F1、F2或F3及其相应的缓冲液混合，在37°C孵育4小时。之后通过标准的SDS-PAGE和Western blot来评估去糖基化的程度。

正如他们预计的那样，蛋白被去糖基化，且各个样品之间的结果相当一致。有趣的是，内糖苷酶F1对他们的蛋白起作用，而F2和F3则*没效果。Caulfield认为，了解哪种酶能使蛋白去糖基化，将带来一些有关寡糖链性质的信息。

Caulfield认为这一试剂盒简单易用，适用于所有研究蛋白糖基化的研究人员。当然，随着蛋白底物不同，反应条件可能也需要调整。

Sigma-Aldrich提供了多种去糖基化试剂盒，包括GlycoProfile I In-Gel Deglycosylation Kit、GlycoProfile II Enzymatic In-Solution Deglycosylation Kit、GlycoProfile IV Chemical Deglycosylation Kit等，适用于溶液或PAGE胶中的糖蛋白，与下游多个分析（如质谱分析或功能研究）兼容。