疫苗DNA残留对人体的潜在危害

对所使用的疫苗，我们zui关心的是疫苗的效果和其安全性。现在很多疫苗是细胞培养疫苗，比如重组（CHO细胞）乙肝疫苗，Vero细胞狂犬病疫苗等大多数疫苗都是用细胞培养的方法生产，而对疫苗的纯化是关键问题，我们要尽可能的去除宿主细胞DNA和宿主蛋白。假若宿主细胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人体将会产生不可预料的后果。就以疫苗DNA残留为例，疫苗DNA残留可能造成插入突变﹑导致抑癌基因失活﹑癌基因被激活等，zui终造成疫苗使用者致癌。

疫苗DNA残留的相关法规

由于有如此潜在的危险性，所以许多机构对疫苗DNA残留制定了相关标准，1986年世界卫生组织规定用细胞系生产的疫苗DNA残留不能超过100 pg /支 ，而在1998年世界卫生组织认为细胞系生产的疫苗DNA残留不能超过10 ng /支，而在1997年美国药品食品卫生监督局规定在美国使用的细胞系疫苗DNA残留不能超过10 pg /支，中国规定的细胞系疫苗DNA残留不能超过100 pg /支。

所以在疫苗生产中要随时对DNA残留进行检测，以便知道每个过程除掉DNA残留的能力。在每一批产品中我们必须检测DNA残留，所以我们必须运用敏感且行之有效的对DNA残留定量的检测方法。通常规定每支疫苗DNA残留不能超过100 pg，也就大约等同于17个甚至更少CHO细胞基因组DNA的含量，对如此微量的DNA残留进行检测，所用的技术方法就必须相当敏感和稳定，现在对DNA残留定量的方法主要有以下三种：
1、分子杂交技术检测DNA残留
2、基于DNA结合蛋白的方法（Threshold® immunoassay）检测DNA残留
3、实时定量PCR法检测DNA残留

分子杂交技术检测DNA残留的原理和方法

分子杂交分析的基本原理是基于DNA探针检测变性而且固定在硝-酸纤维素膜上的宿主细胞DNA。这些探针可以不依赖宿主细胞DNA来制备，例如用随机引物制备探针。探针上标记酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛（Dig）等。由于地高辛标记核酸探针，操作方便、灵敏度高，已标记的探针在4℃贮存可达两年之久，方便随时应用，所以现在常采用地高辛标记核酸探针，用光标记法将光敏Dig标记到探针上，制成光敏-Dig-核酸探针，再与固定在硝–酸膜上的靶核酸进行靶DNA分子杂交，使之与抗Dig-碱性磷酸酶结合，zui后可用不同的检测方式进行检测，发光检测和显色检测均可，灵敏度可达10pg以下（表 1  三种DNA残留检测方法的比较）。

基于DNA结合蛋白的方法（Threshold® Immunoassay）检测DNA残留的原理和方法

Threshold® Immunoassay分析系统是基于两种DNA序列非特异性蛋白，单链DNA（ssDNA）结合蛋白（SSB）和抗ssDNA 的单抗。检测的基本过程是当生物素—DNA单链结合蛋白和尿素酶—抗ssDNA 的单抗与变性的宿主细胞DNA结合zui终形成复合物，通过亲合素将此复合物连接到生物素—硝–酸纤维素膜，在通过洗涤所有非特异性的被洗脱掉，zui后放于有尿素溶液的读数仪，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2 导致PH值发生变化，读数仪根据PH值的变化换算成DNA的量，从而达到检测DNA残留含量的目的。

实时定量PCR法检测DNA残留的原理和方法

荧光定量PCR是基于PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，产物的增加可以通过荧光信号指示，通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中初始模板进行定量分析。定量PCR可实时检测产物量，通过加入已知浓度的标准样品绘制标准曲线，然后根据待测样品在标准曲线中的位置推算初始模板的浓度，从而达到检测DNA残留含量的目的。

三种检测DNA残留方法的比较

3种方法用来检测疫苗DNA残留都要对样品进行相应的处理，这对zui终的结果的准确性至关重要。而杂交相对对样品DNA的损失小，而用Q-PCR需要提取样品的DNA，损失较大。在我们选择那种方法时我们要考虑它的稳定性，敏感性，成本等以至找到*的性价比的方法（表 1），从表1 我们不难发现使用分子杂交的方法是一种比较可行经济实用的方法，目前国内也主要是用此方法。

表 1  三种DNA残留检测方法的比较

罗氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II试剂盒产品简介

产品中文名称：高效DNA地高辛标记和检测试剂盒II

罗氏应用科学部（Roche Applied Science）是zui早致力于向用户提供非放射标记技术的公司之一，让更多的科研工作者们可以避免使用危险的放射性同位素。DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II（第二代）是由罗氏公司研发，并且是在DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（*代）的基础上优化升级的，具有更高的准确性、更好的灵敏度、操作时间更短等特点。自1995年地高辛产品上市以来，尽管有定量PCR技术的应用，DIG系统仍然是非放射性高效标记—检测技术的*，被广泛地应用各种膜杂交及原位杂交技术中。

高效DNA地高辛标记和检测试剂盒II 图片

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罗氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II检测原理

该产品是用地高辛（地高辛：英文名Digoxigenin，简称DIG；又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子）标记的DNA探针，应用于分子杂交和随后的化学发光检测。检测主要分三阶段进行：1. DNA标记：根据随机引物标记技术，生成DIG地高辛标记的DNA探针。 2. 杂交：按照标准杂交方法进行，将地高辛标记的DNA探针用于核酸点杂交，可选择带正电的尼龙膜或纯硝–酸纤维素膜作为杂交膜。 3. 免疫学检测：首先将标记有AP的地高辛抗体与杂交探针免疫结合；然后在477 nm波长下，通过检测碱性磷酸酶与CSPD底物产生的化学发光反应的数值，从而达到免疫检测的目的。

罗氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II的显著特点

★ Accurate and fast—–使用预混合的高效地高辛（DIG）标记的随机引物可以缩短标记DNA探针的操作时间，提高标记物的产量。
★ Sensitive—–在人类DNA的复合物和植物基因组中，可以检测到单个拷贝的基因。
★ Time-saving—–地高辛（DIG）标记的探针可以储存一年以上，杂交液可以反复使用3～5次（具体要根据每次杂交过程中标记探针产生信号的强弱来确定）。

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疫苗DNA残留对人体的潜在危害

对所使用的疫苗，我们zui关心的是疫苗的效果和其安全性。现在很多疫苗是细胞培养疫苗，比如重组（CHO细胞）乙肝疫苗，Vero细胞狂犬病疫苗等大多数疫苗都是用细胞培养的方法生产，而对疫苗的纯化是关键问题，我们要尽可能的去除宿主细胞DNA和宿主蛋白。假若宿主细胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人体将会产生不可预料的后果。就以疫苗DNA残留为例，疫苗DNA残留可能造成插入突变﹑导致抑癌基因失活﹑癌基因被激活等，zui终造成疫苗使用者致癌。

疫苗DNA残留的相关法规

由于有如此潜在的危险性，所以许多机构对疫苗DNA残留制定了相关标准，1986年世界卫生组织规定用细胞系生产的疫苗DNA残留不能超过100 pg /支 ，而在1998年世界卫生组织认为细胞系生产的疫苗DNA残留不能超过10 ng /支，而在1997年美国药品食品卫生监督局规定在美国使用的细胞系疫苗DNA残留不能超过10 pg /支，中国规定的细胞系疫苗DNA残留不能超过100 pg /支。

所以在疫苗生产中要随时对DNA残留进行检测，以便知道每个过程除掉DNA残留的能力。在每一批产品中我们必须检测DNA残留，所以我们必须运用敏感且行之有效的对DNA残留定量的检测方法。通常规定每支疫苗DNA残留不能超过100 pg，也就大约等同于17个甚至更少CHO细胞基因组DNA的含量，对如此微量的DNA残留进行检测，所用的技术方法就必须相当敏感和稳定，现在对DNA残留定量的方法主要有以下三种：
1、分子杂交技术检测DNA残留
2、基于DNA结合蛋白的方法（Threshold® immunoassay）检测DNA残留
3、实时定量PCR法检测DNA残留

分子杂交技术检测DNA残留的原理和方法

分子杂交分析的基本原理是基于DNA探针检测变性而且固定在纤维素膜上的宿主细胞DNA。这些探针可以不依赖宿主细胞DNA来制备，例如用随机引物制备探针。探针上标记酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛（Dig）等。由于地高辛标记核酸探针，操作方便、灵敏度高，已标记的探针在4℃贮存可达两年之久，方便随时应用，所以现在常采用地高辛标记核酸探针，用光标记法将光敏Dig标记到探针上，制成光敏-Dig-核酸探针，再与固定在膜上的靶核酸进行靶DNA分子杂交，使之与抗Dig-碱性磷酸酶结合，zui后可用不同的检测方式进行检测，发光检测和显色检测均可，灵敏度可达10pg以下（表 1  三种DNA残留检测方法的比较）。

基于DNA结合蛋白的方法（Threshold® Immunoassay）检测DNA残留的原理和方法

Threshold® Immunoassay分析系统是基于两种DNA序列非特异性蛋白，单链DNA（ssDNA）结合蛋白（SSB）和抗ssDNA 的单抗。检测的基本过程是当生物素—DNA单链结合蛋白和尿素酶—抗ssDNA 的单抗与变性的宿主细胞DNA结合zui终形成复合物，通过亲合素将此复合物连接到生物素—纤维素膜，在通过洗涤所有非特异性的被洗脱掉，zui后放于有尿素溶液的读数仪，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2 导致PH值发生变化，读数仪根据PH值的变化换算成DNA的量，从而达到检测DNA残留含量的目的。

实时定量PCR法检测DNA残留的原理和方法

荧光定量PCR是基于PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，产物的增加可以通过荧光信号指示，通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中初始模板进行定量分析。定量PCR可实时检测产物量，通过加入已知浓度的标准样品绘制标准曲线，然后根据待测样品在标准曲线中的位置推算初始模板的浓度，从而达到检测DNA残留含量的目的。

三种检测DNA残留方法的比较

3种方法用来检测疫苗DNA残留都要对样品进行相应的处理，这对zui终的结果的准确性至关重要。而杂交相对对样品DNA的损失小，而用Q-PCR需要提取样品的DNA，损失较大。在我们选择那种方法时我们要考虑它的稳定性，敏感性，成本等以至找到*的性价比的方法（表 1），从表1 我们不难发现使用分子杂交的方法是一种比较可行经济实用的方法，目前国内也主要是用此方法。

表 1  三种DNA残留检测方法的比较