BirA生物素蛋白连接酶标准反应试剂盒

• 产品概述: 

  BirA生物素蛋白连接酶标准反应试剂盒由AVIDITY公司生产，生物素连接酶(Biotin Protein Ligase)用于催化生物素化反应，将生物素连接到特定的蛋白上。反应原理是通过ATP三磷酸腺苷中间体(生物素5’-腺苷酸)以和靶向的方式将d-生物素共价连接到生物素受体肽/蛋白上。

  强烈建议使用AviTag氨基酸序列，而不是其他生物素化的肽序列。BirA酶生物素化AviTag序列是天然底物(BCCP)反应速率的两倍，并且比使用的其它肽序列多一个数量级或更多。与肽序列的其他生物素化相比，AviTagTM需要更少的酶量和更短的孵育时间，从而小化与蛋白酶和蛋白质不稳定性相关的辅助问题。

来源：重组蛋白（Escherichia coli）

l 纯度：

 纯度＞95%，无可检测的蛋白酶活性。

l 应用：

生物素受体蛋白的生物素化。

l 储存条件：

干冰运送，解冻后分装，避免反复冻融。

长期保存置于-80℃，短期内使用置于-20℃，频繁使用可短时置于4℃。在4℃条件下保存三个月保可持>90%的酶活性。

10×Biotin Ligase Buffer A、B和D-Biotin储存于-20℃，可反复冻融,，生物素蛋白连接酶BirA，4℃存放一个月，活性保留>80。长期保存-80度，每次解冻，酶活性降低10%。

l 产品成分

BirA biotin-protein ligase：(3mg/ml)

10×Biotin Ligase Buffer A： 0.5 M Bicine，pH 8.3  

10×Biotin Ligase Buffer B： 100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 500 μM D-Biotin

D-Biotin：500 µM D-Biotin

反应体系示例（250ul）（底物浓度 :≤40uM））

    (*每10 nmol AviTag’d底物需2.5μg BirA, 根据底物浓度按倍数放大本体系)

     注意：有些情况可能有必要浓缩您的底物以满足40μM标准。

相关产品信息

影响因素

1  AviTag的底物肽(蛋白质)浓度与生物素化效率  

为了确保生物素化的效率，建议在终的反应混合物中AviTag的底物尽可能接近40μM，反应混合物中的底物浓度越低， 生物素化完成的时间越长。例如，40μM时在30-40分钟内*生物素化，但在4μM时，使用同样的方法需要5个多小时。底物浓度与BirA酶活性的关系如图A。

    2  反应缓冲体系对BirA酶活性的影响

氯化钠（>100 mM）、甘油（>5% W/V）、硫酸铵（>50 mM）等许多常见的缓冲液成分会抑制生物素连接酶的活性。当底物蛋白（多肽）确有必要使用这些试剂时，应尽量降低浓度。底物中可含有Tris(pH 8.0)， 宜浓度为10 mM，不超过50 mM。

3 底物浓度与BirA酶的数量关系

通常，对于每10 nmol底物(40μM)，我们建议2.5μg BiRA酶 生物素化条件30℃下30 – 40分钟或室温下约1小时。或者4℃过夜，ATP在4℃时水解更慢，但该反应过程可能会因为ATP降解引起的不*生物素化，需额外补充ATP解决。

BufferA和BufferB已经针对生物素化反应进行优化，底物浓度不超过40µM。如果底物浓度

达40~80µM，则要加入额外的生物素，反应如下：1份10×BiotinLigaseBufferA，1份

10×Biotin Ligase Buffer B，7份酶底物混合物和1份D-Biotin。如果底物浓度超过80 µM，请酌情稀释底物或与技术人员联系获取帮助。

4  BirA酶纯度

 BirA酶经过测试，显示没有可测量的蛋白酶污染。但较长的孵育时间确实会带来目标蛋白被蛋白酶水解的风险，因此建议使用短的*生物素化目标蛋白的孵育时间。较长的孵育时间溶液中的ATP会随时间水解，降低可用的生物素化反应的ATP。因此，快速完成反应将有利于实现大生物素化。

■ FAQ：

Q：如何阻止蛋白酶降解底物？

          A：本产品的生物素连接酶经严格质量控制，没有蛋白酶活性。如果用于生物素化的底物蛋白是未经纯化的粗提蛋白，建议加入适量的蛋白酶抑制剂，以防止在生物素化的过程中发生降解。

 Q：如何确定参与反应的适本酶量及反应条件？

          A：由于不同蛋白性质差别很大、生物酶反应存在一定的不确定性，说明书中所述反应条件并不*适用于所有蛋白。建议用户可以进行预实验：可先取少量蛋白，分成若干份相同量的底物，加入不同稀释度的酶，相应量的Buffer A、 B， 30℃ 1 h （或其它时间、温度条件）反应，以SDS-PAGE Loading Buffer终止反应后，电泳并转移至NC膜上进行Western Blotting检测（BSA封闭后直接以市售的HRP-Streptavidin孵育， DAB显色），比较生物素化情况，选取适条件。由于Streptavidin与Biotin结合力*，因而用于Western Blotting检测时，只需很少生物素化蛋白即可观察结果。

 Q：如果我的底物蛋白浓度相当低且不容易浓缩，进行生物素化时该怎么办？

          A:在进行相同底物量的酶促反应时加入更多的酶并适当延长反应时间。但有一个问题不容忽视，酶是蛋白质，在酶量增加的时候，引入体系中的蛋白量亦增加了，如果后续的实验不容许出现很大量杂蛋白，那么延长反应时间将是仅有的选择。

Q：是否有阳性对照可以参考？

  A:有阳性对照（BIS-300阳性对照底物试剂盒）

   BIS-300试剂盒包含*生物素化的MBP-AviTag™融合蛋白标准品和未生物素化的MBP-AviTag™融合蛋白，可用作BirA生物   素连接酶作用下蛋白生物素化程度的比较，用于SDS-PAGE凝胶分析或蛋白质印迹分析。