先天免疫系统能够检测所谓的“病原体相关分子模式”（PAMP）。这些包括例如细胞外源核酸。取决于细胞类型的“先天免疫系统”有多明显，它启动针对假定病原体的防御措施的能力也越大。这导致了K2® 转染系统和后来的K4® 转染系统的开发。

使用化学转染方法，特定细胞类型进行内吞作用和增殖的能力发挥了关键作用，因为脂质复合物/复合物最初通过内吞作用逃逸到细胞质中，然后从内体中释放出来。如果在分裂过程中核膜在短时间内是可渗透的，则脂质复合物/复合物或解复合的 DNA 只能渗透到细胞核（即克服“核屏障”）。如果这两个过程中的一个以不完善的形式发生，即使转染方法的应用是最佳的，也可能相应地降低转染效率。因此，低增殖或无增殖的细胞（如原代细胞或神经细胞）或内吞活性低的细胞（如 Jurkat 细胞）被认为难以转染也就不足为奇了。另一个关键因素是先天免疫系统，它针对每种细胞类型的发展各不相同。细胞能够检测外来核酸并进入防御状态。具有低发育先天免疫系统的细胞（例如 HEK293 细胞）因此易于转染，而具有强发育免疫系统的细胞（例如 Jurkat 细胞）则难以转染。
一个加剧的因素是，上面给出的这些现象可能不仅在细胞类型与细胞类型之间*不同，而且在同一细胞类型的不同基因型之间也可能*不同。不同大学甚至同一机构内不同工作组的同名细胞中可能会出现不同的行为，也可以在细胞系的长期传代过程中观察到。这种复杂性将协议参数从一个用户传输到另一个用户的选项减少到最小，即使显然涉及相同的细胞类型。

不; 每个转染试剂都有一组特定的属性，包括：

大肠杆菌的特定组成和比例
每个分子的特定净载量和 pH 值
聚集体稳定性/脂质复合物稳定性

这些不同的特性对它们与 DNA 和所讨论的细胞类型的相互作用有直接和特定的影响。因此，协议参数不能从一种试剂转移到另一种试剂。

不，这是不可能的。每种细胞类型和每种转染试剂的高度特异性特性之间的相互作用非常复杂，以致于对转染效率的预测是徒劳的。另一方面，经验值表明，例如静止细胞、悬浮细胞和原代细胞通常难以转染。但没有规则无一​​例外。

用合成载体系统转染 DNA 的一个基本原则是，这种材料只能在细胞分裂过程中穿透“核屏障”。作为不可避免的结果，必须遵守以下几个方面：
细胞培养传代数不应超过 30 次。每次传代都会发生一定的遗传分化；这意味着最能抵抗传代压力的细胞将不成比例地增殖。此外，细胞培养基的成分会改变细胞的生理状态，因为细胞会根据现有的营养条件调整自身。这导致与原始细胞的遗传差异逐渐扩大。
转染时细胞应尽可能快地生长。细胞应保持在高增殖状态，称为对数期或指数期。通过选择适合快速增殖的培养基并为要使用的细胞类型和适当的格式创建生长曲线，从而为接种和生长持续时间设置最佳细胞数量，可以最容易地实现这一阶段。由于生长抑制，定期保持在汇合条件下的细胞只有在经过几次传代后才能恢复其全部生长潜力。
 

 
光学汇合与实际汇合不同。上面的生长曲线表示目视确定的汇合（覆盖整个生长表面）对应于实际汇合（生长曲线的第 5 阶段）的程度。这两个汇合值通常有显着差异。以图中所示的 COS7 细胞为例，很明显，在最常见的情况下，仅实现了早期生长期 3。出于这个原因，如果要在贴壁细胞上执行该过程，作为规则，细胞在转染当天应具有约 90% 的视觉确定的汇合度。
 

 

脂质复合物的形态一方面与阳离子脂质的类型和所用转染试剂的脂质组成密切相关，另一方面与遗传物质与转染试剂的比例密切相关。每种细胞类型都显示出特定的转染能力，具体取决于产生的脂质复合物形态
。可以通过应用优化过程确定以下最佳转染参数：
首先必须确定 DNA/RNA 与脂质的最佳比例。通常认为，脂质复合物需要净正电荷才能与带负电荷的细胞膜表面静电相互作用，以实现成功的内吞吸收。在大多数情况下，这个比例大约为 1-7µl 脂质对 1µg DNA/RNA。
第二个关键因素是每个细胞的 lipoplex 量；如果这太高，产生的毒性会过度补偿转染的成功。因此应改变脂质复合物的量以反映已知的 DNA/RNA 与脂质的最佳比例。

阳离子脂质能够扩散到细胞膜中并使其不稳定。随着脂质复合物中脂质含量的增加，这可能是毒性增加的主要原因。出于这个原因，与 DNA/RNA 量相关的高水平脂质只能在有限的范围内使用。
由于未知的原因，脂质复合物对细胞的毒性影响比转染试剂本身要大得多。
必须假设先天免疫系统在检测到细胞内的外来核酸后触发细胞凋亡，这很难与毒性相区分。
这导致了第二个限制：过多的 lipoplex 水平会损害转染成功。毒性的另一个原因可能是通过表达或抑制的蛋白质本身进行所需的细胞操作，这可能对细胞生理学产生重大影响。在这种情况下，最佳转染可能会导致高细胞死亡率，这只能通过下调转染效率来避免。

细胞培养中使用的血清（例如 FCS、FBS）是一种高度复杂的不确定混合物，由水溶性血液成分（如生长因子和营养物质）组成，并且总是对转染成功有重大影响。
血清具有广泛的脂质复合物抑制特性。因此，在脂质复合物形成（结合转染试剂和遗传物质）期间不得存在血清。
用这些转染试剂形成的脂质复合物可以与含血清的细胞培养基一起添加到细胞中，而不会影响转染结果。事实上，当存在血清时，这些试剂会定期提供更高水平的转染效率。
血清支持细胞生长行为。其成分，如生长激素，可显着促进待转染细胞的生长和细胞分裂率，从而显着提高转染效率。在选择合适的细胞培养基时，还应考虑细胞的增殖行为。如果存在多种可能性，则应选择细胞增殖率最高的培养基。
由于血清的保质期极其有限（最长 1 个月），应注意所用血清在有效期内，因为使用过期血清会显着损害细胞所需的成分。在这种情况下，细胞显示出*不同和减少的生长模式（见图），并且无法再预期最佳转染结果。
血清的质量可能因批次而异。如果所有其他参数保持不变，成分的多样性会导致不同的转染结果。

是的，因为细胞培养物的任何污染，无论是真菌、病毒还是细菌，都会对转染结果产生重大影响，通常会导致整个细胞培养物死亡。由于支原体污染具有不可见且不会导致细胞死亡的特殊特性，因此污染可能会在很长一段时间内未被发现。然而，这些细菌对转染成功有广泛的影响：
由于精氨酸需求增加，细胞生长显着降低（见图）
支原体被先天免疫系统识别并调节细胞因子的产生
支原体引起染色体畸变
支原体滞留在细胞膜中并可能调节细胞膜过程，如内吞作用。
有和无支原体污染的 HeLa 细胞的不同细胞生长：
 

 
支原体污染对转染效率的影响：
 

 
在 48 孔板上用 pCMVßgal 转染 HeLa 和 HepG2 细胞。通过 ONPG 和 BCA 分析评估比吸收值。下图显示了支原体污染对 HeLa 和 HepG2 细胞的广泛影响（未污染细胞效率的 17% 和 5.6%）：

支原体可以在几乎所有已知的细胞类型中增殖，因此无处不在。据估计，大约 80% 的日本细胞培养物、65% 的阿根廷细胞培养物和 15% 的美国细胞培养物被支原体污染。主要来源是实验室工作人员以及胰蛋白酶和血清，它们是从动物来源分离的细胞培养添加剂。

一种长期存在的支原体检测方法是 DAPI 染色。然而，由于其极低的检测灵敏度，该方法仅显示出显着水平的污染。PCR 方法明显更灵敏，因此是检测方法。Biontex 提供基于 PCR 的检测试剂盒MycoSPY®和MycoSPY® Master Mix，它们甚至可以识别支原体基因组的单个拷贝。如果细胞培养物受到污染，我们建议使用MycoRAZOR®进行处理。

基本上，具有更高纯度的遗传材料将始终提供更好的转染结果。需要特别注意的一个因素是被称为内毒素的脂多糖污染。它们在制造过程中由细菌引入，即使以微量存在，也会被先天免疫系统检测到，从而显着损害转染过程。应注意遗传材料的清洁包括去除内毒素，可提供商业试剂盒。不建议将基于“小量制备方案”的质粒清洗用于转染目的，因为遗传物质的特定结构直接影响转染成功：
由于启动子具有特定的表达率，因此细胞具有特征量或每单位时间的表达产物量。
根据细胞类型，待表达基因或产生的蛋白质的特定特征可能显着影响细胞的生理学，甚至导致细胞死亡。

遗传物质的尺寸和三级结构也会影响潜在的转染成功。一般来说，以下原则适用：
细胞的转染能力随遗传物质的量而下降
超螺旋质粒在瞬时转染中更有效，而线性 DNA 更适合于稳定转染。

Lipoplexes 粘附在细胞培养容器的自由塑料表面上，因此在转染过程中丢失。这就是为什么不能简单地将针对特定容器格式确定的最佳参数与其他容器格式成比例地应用的原因。
使用的容器规格越小，lipoplex 的量/mm² 就必须越高。当从 6 孔培养皿缩小到 96 孔格式时，必须使用大约三倍于 lipoplex / cm² 的量才能实现可比的转染效率。

不。鉴于常见问题解答中给出的大量参数是成功转染的影响因素，很明显，提供通用的特定协议是徒劳的。我们网站上列出的已发表案例研究只能说明如何尽快实现成功转染，一般不能声称具有普遍适用性。最后可能需要在自己的实验室环境中进行优化。

在室温或 4°C 下长期储存期间，脂质体制剂往往会凝结。这意味着大小分布向更大的脂质体移动，这可能对转染效率产生负面影响。冷冻和解冻脂质是一种已知的生产脂质体的方法，因此也可用于为某些转染试剂重建理想的脂质体大小分布。
为此目的，该试剂在冰箱中冷冻，然后在室温下解冻。软涡旋后，试剂再次储存在 4°C。建议在使用 METAFECTENE 转染试剂系列（METAFECTENE®、METAFECTENE® PRO、METAFECTENE® SI）和K2® 转染试剂/ K4® 转染试剂，两个月后。

原则上，核酸和阳离子脂质或聚合物等带电分子倾向于粘附在玻璃和塑料表面。虽然在高浓度溶液的情况下由此产生的质量损失可以忽略不计，但用于形成脂质复合物的稀溶液的条件是不同的。根据我们的经验，这种影响是不可避免的。聚丙烯仍然是 lipoplex 形成容器的最佳可用材料（在聚苯乙烯和玻璃之前）。因此，应注意将稀释的溶液尽可能短地留在容器中。Lipoplexes 还倾向于粘附在塑料表面上，此外，还会“老化”。这意味着 lipopolex 聚集成更大的单元，在胞吞作用中不能被细胞吸收，这降低了它们的转染能力。因此，